李 祥，朱海霞

(青海大学 农林科学院，农业农村部西宁作物有害生物科学观测实验站，青海省农业有害生物综合治理重点实验室，青海 西宁 810016)

近年来，世界各国大力提倡“绿色农药”，在众多的新型农药中，生物源农药以其在自然环境中自身易降解、无公害的优势已成为绿色农药的首选之一。将植物病原菌或其产生的次生代谢物制成微生物除草剂应用于田间，是现代农业防治田间杂草最具潜力的方式。据不完全统计，目前已有40多个属80多个种的病原真菌被开发成了微生物源除草剂。最早美国利用棕桐疫霉开发出的Devine制剂来防除柑橘园莫伦藤()；加拿大利用梨孢霉属病原菌开发出的制剂对狗尾草7 d后防效达87%；澳大利亚引进的无眠单胞锈菌()能够有效防治桉叶藤()；美国登记的Dr. Bioseoge可用于防治油莎草()，其对油莎草幼芽抑制率可达66%，对其生长抑制率可达40%左右。国内最早开发出的生防除草剂“鲁保一号”对菟丝子有很好的防效。强胜等开发研制出的生物除草剂“杀草毒素AAC-Toxin”对杂草的防效2 d内达100%。链格孢菌(spp.)产生的次生代谢物已成为开发生物源除草剂的重要菌种。朱海霞等研究发现，极细链格孢菌HZ-1可作为防除阔叶杂草的生防潜力菌。利用植物病原菌或其次生代谢产物开发生物源除草剂，是新型生物源农药开发的主要方向。

青海省的气候特点与生态条件决定了生物多样性的特殊性，该地区在孕育了丰富杂草的同时，也隐藏着大量的杂草病原微生物。近年来，青海省农业有害生物综合治理重点实验室一直致力于杂草生防资源的广泛深入研究，以期挖掘出更多可供选择的生防材料用于发展高效、安全的生物除草剂。本研究以患病甘草根部分离获得的菌株GD-0221为研究对象，测定该菌株对5种田间常见阔叶杂草离体和盆栽致病性，以及对5种青海主栽作物青稞()、小麦()、油菜()、蚕豆()和豌豆()的安全性，并利用形态学和进化树明确其分类地位，为该菌株的进一步开发利用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

甘草根部病样采自青海省西宁市贵德县河西镇本科村(36°03′43″ N，101°43′56″ E)农家自留地中。甘草病样症状表现为植株完全枯死，叶色呈褐色，茎杆干枯萎蔫，根部变成黄褐色，根部出现坏死，部分出现腐烂。

1.2 菌株的分离与纯化

参照方中达的方法进行菌株分离。用无菌水将病样根部泥土冲洗干净，在无菌操作台中先用NaClO溶液(有效氯含量≥0.1%)浸泡叶片3 min，用无菌水冲洗3次，用体积分数75%乙醇浸泡30 s，用无菌水冲洗3次，置于无菌操作台中晾干。取病健交界处5 mm×5 mm的小块接于PDA培养基中，每皿接5～8个病样小块，每种接5皿，于恒温(25 ℃)培养箱中培养5 d后纯化菌株。

1.3 菌株鉴定与进化树构建

1.3.1 形态学鉴定

将纯化的菌株于PDA培养基上25 ℃培养，定期观察菌落生长速度、菌落形态与色泽变化，光学显微镜下观察其菌丝、孢子形态。结合《真菌鉴定手册》进行初步鉴定。

1.3.2 分子生物学鉴定与进化树构建

菌株基因组DNA的提取与含量测定、基因ITS区的PCR扩增与测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。其中，ITS通用引物为ITS 1：5′-CCGTGTGTGCGG-3′和ITS 4：5′-TCTCG-CTTATTGTGGC-3′。

利用Chromas软件对测序结果进行序列修正，通过NCBI Blast检索与GD-0221序列同源性高的DNA序列，利用MEGA 7.0软件近邻归群法(Neighbor-Joining， N-J)构建系统发育树，确定菌株的分类地位。

1.4 离体叶片致病性测定

将纯化后的菌株利用离体叶片试验进行筛选，在无菌操作台将纯化培养所得的菌株平板用打孔器(Φ=8 mm)打菌饼，将杂草密花香薷()、藜()、冬葵()、酸模叶蓼()、萹蓄()叶片放在铺有滤纸的培养皿(Φ=90 mm)中，用无菌水将滤纸浸湿提供湿润环境，再将菌饼放在叶片上面，于25 ℃恒温培养箱培养，每个处理重复3次，以未接菌的PDA培养基作为对照，7 d后观察病斑面积，病斑面积=1/4×长×宽×3.14。调查发病程度，参照文献[19]进行分级：0级，叶片无任何病斑；1级，叶片上有病斑产生；2级，病斑扩展至1/3～2/3叶片；3级，2/3以上的叶片坏死；4级，叶片全部枯死变色。

1.5 盆栽杂草致病性测定

1.5.1 发酵液制备

将菌株在PDA培养基上培养7 d后，用Φ=8 mm的打孔器在菌落边缘处取菌块，接种到PDB培养液(每瓶250 mL)，每瓶接4～8块，在25 ℃、180 r·min摇床振荡培养5～7 d。将发酵液用无菌3层纱布过滤后，用无菌水将孢子浓度稀释成(1.0×10～1.0×10)CFU·mL备用。

1.5.2 杂草移栽

将青海省农林科学院试验田生长的4～5叶期健康杂草密花香薷()、藜()、冬葵()、酸模叶蓼()、萹蓄()苗移栽于花盆(盆底直径Φ=15 cm)中，温室[(25±1)℃]内培养1周，待其生长正常后备用。

1.5.3 发酵液接种

将发酵液装入300 mL无菌喷壶中，加入1～2滴黏附剂吐温80，用喷雾接种法在健康杂草植株上接种，接种量控制在每盆25～30 mL，连续接种3次。以接种无菌水的健康植株作为对照。接菌后的杂草植株用厚度0.06 mm塑料薄膜保湿培养12 h，置于温室[(25±1)℃]培养。每处理设置3次重复。

1.5.4 发病率计算

观察接种杂草的发病情况，7 d后调查杂草发病程度，计算发病率。调查发病程度，分级标准同1.4节。

病情指数(%)

1.6 作物安全性测定

将青海省5大主栽作物青稞(lg)、小麦()、油菜()、蚕豆()和豌豆()种子在培养皿(Φ=90 mm)中催芽后分别种植于花盆中，温室[(25±1)℃]内培养，待其生长至4～5叶期。以每盆25～30 mL的接种量进行喷雾接种，连续接种3次。以接种无菌水的健康植株作为对照。接菌后的植株用厚度0.06 mm塑料薄膜保湿培养12 h，置于温室[(25±1)℃]培养。每处理设置3次重复。观察植株发病情况。

1.7 数据处理

运用Excel 2010和DPS 9.01软件进行统计分析，采用Duncan新复极差法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定

2.1.1 形态学鉴定

GD-0221菌株在PDA培养基上呈白色绒毛状，后期背面呈粉色，营养菌丝体发达，边缘整齐；在显微镜下观察，GD-0221菌株的小型分生孢子散生于菌丝间，孢子形态呈卵圆型或肾型，透明状无隔膜；其孢子梗中间有明显隔膜，孢子梗间呈锐角或直角分布(图1)。

A，GD-0221菌株正面形态；B，GD-0221菌株背面形态；C和D，GD-0221的分生孢子形态；E，GD-0221孢子梗形态。A， Positive morphology of GD-0221 strain； B， Back morphology of strain GD-0221； C and D， Conidia morphology of GD-0221； E， GD-0221 spore stalk morphology.图1 GD-0221菌株形态特征Fig.1 Morphological characteristics of GD-0221 strain

2.1.2 分子水平鉴定与进化树构建

测序结果显示，GD-0221菌株的ITS序列长度为504 bp(GenBank序列号ON600532)。将其在NBCI内进行BLAST比对后，发现该菌株与isolate F1的序列相似度达93%，选择为外群，获取与其不同相似度的10株菌株，利用MEGA7.0软件构建系统发育树，GD-0221相较于其他几种菌，与isolate F1的亲缘关系较近(图2)。结合显微结构的形态学特征，确定菌株GD-0221为尖孢镰刀菌()。

图2 基于GD-0221菌株5.8S-ITS rDNA基因序列构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on 5.8S-ITS rDNA gene sequence of GD-0221 strain

2.2 离体叶片致病性测定

由图3和表1可知，接种7 d后，该菌株对5种阔叶杂草离体叶片均表现出不同程度的致病性。该菌株可以使密花香薷叶片产生病斑，叶片周围长出白色菌丝，叶片呈黑色枯死状。藜叶片接有菌饼的周围产生病斑，叶片局部黄化，且长有白色菌丝。冬葵叶片接有菌饼的周围先出现病斑，之后黄化，最终变为褐色，表面有大量菌丝。酸模叶蓼叶片接种菌饼后，先是出现病斑，逐渐扩大，最终使叶片完全枯死为褐色，叶片背部产生白色菌丝。萹蓄叶片接种菌饼后，叶片背部先产生病斑，之后逐渐扩展至整个叶片，叶片呈现褐色枯死状，背部产生大量白色菌丝。离体叶片致病力整体表现为冬葵>酸模叶蓼>密花香薷>萹蓄>藜。

A，密花香薷；B，藜；C，冬葵；D，酸模叶蓼；E，萹蓄。图4同。A， Elsholtzia densa； B， Chenopodium album； C， Malva verticillata； D， Polygonum lapathifolium； E， Polygonum aviculare. The same as in figure 4.图3 GD-0221菌株对5种阔叶杂草离体叶片致病性(接种7 d)Fig.3 Pathogenicity of strain GD-0221 to isolated leaves of five broadleaf weeds (7 days after inoculation)

表1 菌株GD-0221对离体杂草的致病力比较(接种7 d)

2.3 盆栽杂草致病性测定

接种7 d后，5种杂草的发病率为20.00%～85.67%，5种杂草的病情指数为13.75%～81.25%。致病效果由高到低表现为密花香薷>萹蓄>藜>酸模叶蓼>冬葵。接种14 d后，5种杂草的发病率为33.33%～100.00%，病情指数为27.50%～100.00%。GD-0221菌株除了对冬葵表现轻微致病性以外，对密花香薷、藜、酸模叶蓼、萹蓄均表现出强致病性。密花香薷和萹蓄的发病率分别为100.00%和98.33%，冬葵发病率最低，为33.33%，密花香薷和萹蓄的病情指数分别为100.00%和95.00%，冬葵的病情指数为27.50%(表2)。接种14 d后5种阔叶杂草的致病效果见图4，密花香薷叶片上呈现出大量病斑，

表2 菌株GD-0221对5种杂草的发病率与发病指数

图4 GD-0221菌株对5种阔叶杂草的致病性(接种14 d)Fig.4 Pathogenicity of strain GD-0221 to five broadleaf weeds (14 days after inoculation)

植株干枯萎蔫；藜植株叶片有卷曲，大量枯萎，叶缘症状加重；冬葵植株叶片叶缘部位出现卷曲和干枯；酸模叶蓼叶片上产生大量斑点，且叶缘部位萎蔫枯死；萹蓄植株叶片病斑蔓延至全部叶片，植株全部萎蔫。

2.4 作物安全性

接种GD-0221菌株发酵液7 d后，青稞、小麦表现安全，油菜、蚕豆和豌豆表现不安全(图5)，说明该菌株对2种禾本科作物表现安全。豌豆虽未表现出症状，但植株生长缓慢。接种油菜3 d后，叶片上出现少量病斑，7 d后，叶片表现为枯死状，植株矮化。蚕豆表现为生长缓慢，叶片卷曲，接种3 d后，植株叶片上产生病斑，7 d后病斑扩展至整个植株，病斑平均面积达0.5 cm。

A，青稞；B，小麦；C，豌豆；D，油菜；E，蚕豆。A， Hordeum vulgare； B， Triticum aestivum； C， Pisum sativum； D， Brassica campestris； E， Vicia faba.图5 GD-0221菌株对5种主栽作物安全性Fig.5 Safety of strain GD-0221 on five main crops

3 结论与讨论

镰刀菌属()是一类寄生在植物体或土壤的丝状真菌，包含多种植物致病真菌。据报道，目前用于杂草防除的植物病原真菌主要来自于镰刀菌属()、链格孢菌属()等。木贼镰刀菌除了使某些中药材、观赏植物等感病，还对恶性杂草具有很强的防治效果，具有除草潜力。孔令晓等从列当()中分离出的镰刀菌可有效防治寄生在向日葵中的列当，具有开发成生物源除草剂的潜力。Oleskevich等从自然感病的悬钩子属植株上分离出来的镰刀菌有很好的除草效果。

尖孢镰刀菌应用比较广泛。在医疗领域，Wang等从牛樟树内生真菌尖孢镰刀菌中分离到的beauvericin具有很好的抗癌活性；Cui等从银杏内生真菌尖孢镰刀菌中分离得到的ginkgolide B是血小板活化因子拮抗剂，可用于治疗缺血性脑中风的痰瘀阻络证。在植物病害领域，尖孢镰刀菌作为镰刀菌属中具有强致病力的菌株，主要通过分泌致病毒素来侵染植物，直接穿透植物根和维管束组织，引起多种植物的枯萎病和根腐病。在杂草防除方面，张蕴等筛选出的尖孢镰刀菌MF06，其乙酸乙酯萃取物对反枝苋根的生长有较好的抑制活性；张键等利用从列当上分离的尖孢镰刀菌防控列当对向日葵的寄生。本研究从自然感病的甘草根部分离得到尖孢镰刀菌GD-0221，对阔叶杂草密花香薷、藜、冬葵、酸模叶蓼、萹蓄均具有致病性，说明尖孢镰刀菌可用于更广泛杂草类群的防除，具有很好的开发应用前景。

本研究分离得到的菌株GD-0221对青海省常见的5种农田阔叶杂草具有广谱的除草效果，对禾本科作物表现安全，对阔叶作物表现不安全。因此，GD-0221具有开发为禾本科作物田防除阔叶杂草的潜力。生物除草剂开发过程中最关键的两大因素是致病力和安全性。本研究从致病性、作物安全性及其分类地位等方面做了基础研究，下一步将对该菌株的剂型、田间药效、除草机理等进行系统研究，为将该菌开发成为禾本科作物田微生物除草剂提供理论基础和技术支持。