丁兆雪，王佳洁，沈中浩，周晓龙，杨松柏，金航峰，赵阿勇，汪 涵

(浙江农林大学 动物科技学院·动物医学院，浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室，浙江 杭州 311300)

近年来，微小RNA(microRNA， miRNA)在猪肉性状调控中的重要作用被大量报道。此前的研究表明，miR-22可以抑制猪骨骼肌卫星细胞(PMSCs)的增殖，促进PMSCs的分化。此外，本研究前期发现，miR-22在红肌肌肉中的表达量要显著低于白肌肌肉。进一步研究发现，miR-22前体上游序列存在与肉色值(红度值)极显著相关的NC_010454.4：g.47913559 G>A 突变位点，且在不同基因型个体背最长肌中miR-22的表达水平存在显著差异。因该突变位点临近猪miR-22前体序列，我们推测该位点所在片段序列可能对miR-22的表达起到重要调控作用，可能是影响猪肉色性状的一个重要遗传标记。

CRISPR/Cas9 技术是目前应用最为广泛的基因定点编辑技术，在猪肌肉相关基因功能及育种应用相关研究中，利用CRISPR/Cas9技术已成功对猪肌肉生长抑制素MSTN基因进行定点编辑，同时出现了经典的双肌臀表型。此外在中国蓝塘猪胎儿成纤维细胞中应用CRISPR/Cas9 技术对2基因进行精确编辑，成功获得了低背膘厚、高瘦肉率的猪只。本研究通过利用CRISPR/Cas9技术对猪miR-22前体上游包含NC_010454.4：g.47913559 G>A 位点的一段序列进行编辑，构建了猪miR-22前体序列上游基因突变的猪肾细胞(PK15)模型，来探究猪miR-22前体上游序列对miR-22表达的影响，为后续进一步探明该片段序列在猪肉色性状调控中发挥的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

CRISPR/Cas9系统使用的pX459载体及猪PK15细胞系购自中国典型培养物保藏中心；DH5α感受态细胞、无内毒素质粒中提试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；氨苄青霉素(Ampr)、青链霉素混合液均购自于Solarbio公司；嘌呤霉素(Puromycin dihydrochloride)购自MCE公司；胰酶(0.25% Trypsin-EDTA 1X)、Lipofectamine3000转染试剂盒均购自于Thermo Fisher公司；磷酸盐缓冲液(PBS)、胎牛血清(FBS)、DMEM培养基均购自于HyClone公司；RNA提取TRIzon Reagent、pMD19-T载体、PrimescriptRT-PCR Kit(RR014a)均购自于TaKaRa公司；T4 PNK酶、T4 DNA连接酶、Ⅰ酶均购自于NEB公司；定量试剂盒EvaGreen 2×qPCR Master Mix购自苏州爱必梦生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 sgRNA序列设计与合成

在E-CRISP Design网站(http：//www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)设计靶向猪miR-22前体上游突变位点NC_010454.4：g.47913559 G>A所在一段序列的两条sgRNA，在sgRNA的上下游5′端分别加上Ⅰ酶切位点的黏性末端(CACC/AAAC)，由杭州有康生物技术有限公司合成(表1)。取sgRNA上下游各1 μL(100 mmol·L)，10×T4 Ligation Buffer(NEB) 1 μL，T4 PNK酶(NEB) 0.5 μL，加去离子水将反应体系配至10 μL，短暂离心后在PCR仪中37 ℃反应1 h，95 ℃ 5 min，后以0.1 ℃·s降至25 ℃，使其形成双链sgRNA，立刻使用或-20 ℃保存。

表1 sgRNA序列信息

1.2.2 CRISPR/Cas9系统表达载体的构建

将退火形成的双链sgRNA稀释成100 μmol·L工作液，取工作液1 μL与经Ⅰ酶切的pX459质粒16 ℃连接过夜，将连接产物转化进DH5α感受态细胞中，取200 μL菌液涂布于含1 μg·mL氨苄青霉素的固体LB培养皿中，37 ℃培养过夜。挑取单菌落接种于含1 μg·mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，37 ℃恒温摇床过夜。菌液送至杭州擎科生物科技有限公司测序验证。选择正确的单克隆，扩大培养后使用无内毒素质粒中提试剂盒提取质粒，立刻使用或-20 ℃保存。

1.2.3 细胞培养和最适嘌呤霉素致死浓度测定

将PK15细胞从液氮中取出，在37 ℃恒温水浴锅中缓慢摇晃解冻，加入1 mL含10%FBS的DMEM完全培养基并混匀，1 200 r·min离心5 min，去上清。再次加入9 mL含10%FBS的DMEM完全培养基重悬细胞，放置于37 ℃、5% CO培养箱中培养。将生长状态良好的PK15细胞接种于6孔板，待细胞汇和度长至80%～90%，分别更换含0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2.0、2.5 μg·mL嘌呤霉素的完全培养基，观察细胞死亡情况，取筛选4 d后细胞全部死亡的嘌呤霉素浓度，作为转染后的加药浓度。

1.2.4 细胞转染和阳性克隆筛选及验证

将PK15细胞接种于6孔板中，待细胞汇合到80%～90%，准备转染。按照Lipofectamine3000转染试剂盒说明，将每孔2 μg质粒共转染至PK15细胞中。转染24 h后，更换含有1.5 μg·mL嘌呤霉素的完全培养基，用于筛选成功转染的PK15细胞。筛选4 d后换正常完全培养基，恢复生长，直至细胞长满培养皿后收集细胞，一部分用于提取基因组DNA，另一部分液氮冻存并编号。通过Primer Premier.5软件设计一对扩增包含猪miR-22前体上游突变位点NC_010454.4：g.47913559 G>A所在序列的引物，引物序列为F：5′-CCCCAGAGACCCCCAAAA-3′，R：5′-GGGCAGAGGGCAACAGTT-3′。随后将PCR扩增后的目的片段，按以下体系与T载体连接，目的片段 3 μL，pMD 19-T载体 0.5 μL，Solution I 5 μL，去离子水1.5 μL，短暂离心后在PCR仪中16 ℃反应4 h。连接好的T载体经过DH5α感受态细胞转化后，涂板后随机挑取单菌落进行测序验证。

1.2.5 qRT-PCR检验miR-22表达量

将测序后发现存在突变的PK15细胞和野生型PK15细胞复苏，置于6孔板中培养，待细胞汇合度长至80%～90%，使用Trizol法提取细胞RNA，用Agilent 2100生物分析仪系统(Agilent Technologies，USA)测定RNA的质量和浓度。采用茎环法设计猪miR-22的定量引物，引物主要包括miR-22特异性反转录引物，上游引物和下游引物(表2)。根据TaKaRa RR014a反转录试剂盒将miRNA反转录为cDNA。10 μL qRT-PCR反应体系为：EvaGreen 2×qPCR Master Mix 5 μL，Forward Primer 0.3 μL，Reverse Primer 0.3 μL，cDNA 3.5 μL，去离子水 0.9 μL；qRT-PCR程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，进行39个循环，每个样本3个重复。采用 2-△△C法计算miR-22的相对表达水平。

2 结果与分析

2.1 靶向猪miR-22前体上游序列的pX459-sgRNA重组载体的构建

将转化后的pX459-sgRNA1和pX459-sgRNA2选取单菌落进行测序，通过DNAMAN 8.0软件进行序列比对后，结果显示，2条sgRNA均成功插入pX459载体(图1)，表明靶向miR-22前体上游序列的pX459-sgRNA重组载体构建成功。

a， pX459-sgRNA1靶点； b， pX459-sgRNA2靶点。a， Target of pX459-sgRNA1； b， Target of pX459-sgRNA2.图1 重组载体pX459-sgRNA的鉴定Fig.1 Identification of recombinant vector pX459-sgRNA

2.2 PK15细胞嘌呤霉素最适致死浓度筛选

使用嘌呤霉素处理野生型PK15细胞，结果显示，处理4 d后致死细胞的最低浓度为1.5 μg·mL(图2)，可将该浓度作为后续细胞筛选浓度。

表2 miR-22茎环RT-PCR相关引物

图2 不同浓度嘌呤霉素处理PK15细胞(96 h)Fig.2 PK15 cells treated with different concentrations of puromycin (96 h)

2.3 PK15编辑细胞模型的鉴定

培养pX459-sgRNA1和pX459-sgRNA2转染后的PK15细胞，提取细胞基因组DNA，PCR扩增miR-22前体上游序列片段，使用DNAMAN8.0软件对测序结果进行比对分析。结果显示，共挑取的81个阳性克隆中，共检测到6种突变类型(图3)，突变率达60.49%(表3)。

红色为Cas9识别位点PAM，紫色为突变碱基。1～6代表突变类型。Red was Cas9 recognition site PAM， purple was mutant base.1-6 were mutations.图3 基因编辑后PK15细胞miR-22前体上游序列测序分析Fig.3 Sequencing of miR-22 precursor up-stream sequence of PK15 cells after gene editing

表3 基因编辑后PK15细胞miR-22前体上游序列突变比率

2.4 猪miR-22前体上游序列突变对miR-22表达量的影响

定量检测野生型PK15细胞和转染pX459-sgRNA1和pX49-sgRNA2后的PK15细胞中miR-22的相对表达量。结果显示，miR-22和U6定量熔解曲线均只有单峰存在，引物特异性强，产物单一(图4)。与野生型相比，基因编辑后的PK15细胞中，miR-22的表达量极显著下调(图4)。这表明，猪miR-22前体上游序列片段发生突变可有效地抑制miR-22的表达。通过分析发现，猪miR-22基因位于其宿主基因2的第2外显子内， 而本研究编辑的序列片段临近miR-22 前体序列，位于2内含子区，属于非编码序列(图5)。

A， miR-22相对表达量； B， miR-22熔解曲线； C， U6熔解曲线。** 表示差异极显著(P<0.01)。A， Relative expression of miR-22； B， Dissociation curve of miR-22； C， Dissociation curve of U6. ** indicated the difference was significant (P<0.01).图4 qRT-PCR检测基因编辑后PK15细胞中miR-22的表达量Fig.4 Expression of miR-22 was detected by qRT-PCR after gene editing in PK15 cells

图5 编辑的靶向序列与猪miR-22前体序列位置关系Fig.5 Position relationship between edited target sequence and porcine miR-22 precursor sequence

3 结论与讨论

Cas9能将融合蛋白及RNA结合在任何双链DNA序列处，这一特殊功能给生物体功能研究和改造带来巨大贡献。本研究在猪miR-22前体上游序列片段的上下游各构建了一个pX459-sgRNA质粒。研究表明，采用双重sgRNA-CRISPR/Cas9敲除策略能有效地提高编辑效率，结合非同源末端连接(NHEJ)使得编辑过的细胞能够稳定遗传。Bonafont等采用双重sgRNA-CRISPR/Cas9技术获得了敲除率达到66.5%的71基因突变小鼠。在本研究中，在编辑的17组细胞中，有15组的编辑效率≥50%。同时，在本研究选取的81个阳性克隆中，miR-22前体上游序列的敲除率为60.49%。这表明，本研究针对miR-22前体上游序列片段设计的2条sgRNA能有效地实现对目标基因的编辑。

已有研究发现，miRNA基因序列遗传变异的出现可能会影响miRNA的转录表达，继而影响其靶向mRNA的功能变化，最后导致个体表型性状发生变异。因此，越来越多的研究也开始通过检测miRNAs基因上存在的突变，来分析其与猪主要经济性状间的关联性。例如，Lei等发现miR-27a基因中的T>C突变与大白猪产仔数性状存在相关，并可能用作育种程序中产仔数性状的选育标记。在猪 miR-206上发现存在SNP 与滴水损失、背膘以及瘦肉率等肉质性状显著相关。此外，还发现miR-133b上同样存在SNP与肌纤维总数，眼肌面积及肌肉pH值显著关联。本研究发现，编辑后的细胞中miR-22的表达量相对于野生型细胞下调了约50%，猪miR-22前体上游序列片段发生突变会影响miR-22的表达。进一步分析发现，本研究编辑的序列片段位于miR-22宿主基因2基因内含子区，属于非编码序列(图5)。此前的研究表明，内含子可作为增强子或启动子元件发挥作用，位于内含子区的 SNP 也可以影响内含子的增强子或启动子活性进而调控基因转录。此外，内含子还能影响mRNA剪接、RNA 折叠/加工，进而影响RNA转录水平。因此，我们推测本研究所靶向编辑的序列片段可能存在调控下游miR-22表达的调控元件，但其作用机制仍有待深入研究。

综上，本研究证实CRISPR/Cas9系统能在猪PK15细胞中实现对miR-22所在基因的高效编辑，该模型也为下一步对该序列片段在猪肉色性状调控中发挥的作用机制研究奠定了重要基础。