曾荟，邱韵静，谭梓君，魏梅，曹斯琼，徐敏，李国卫，何民友

广东一方制药有限公司，广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山528244

墨旱莲为菊科植物鳢肠L.的干燥地上部分，具有滋肝补血、凉血止血功效，临床用于牙齿松动、须发早白、眩晕耳鸣、腰膝酸软，及阴虚血热之吐血、衄血、尿血、血痢、崩漏下血、外伤出血。全国大部分地区均有分布，主产于江苏、江西、浙江、广东、湖北等地。目前已从墨旱莲中分离并鉴定出的化合物有三萜及其皂苷、甾体、黄酮、香豆素、木脂素、噻吩、生物碱、酚酸以及聚乙炔等。药理学研究表明，墨旱莲具有很强的保肝、抗炎、抗菌、抗自由基、抗氧化、抗纤维化、抗肿瘤、抗骨质疏松等作用。

墨旱莲为一年生本草，花期7－8月，果期8－11月，花开时采割地上部分，部分地区可根据花期适当延长至11月。为保证墨旱莲药材的质量，应在合适的花期进行采收，合理控制墨旱莲药用部位的花、叶、茎比例。目前，2020年版《中华人民共和国药典》墨旱莲药材项下仅对单一化学成分蟛蜞菊内酯进行含量测定，难以区分墨旱莲不同药用部位。本研究通过超高相液相色谱法（UPLC）建立墨旱莲的特征图谱，并对墨旱莲中5种成分进行含量测定，结合相似度分析、聚类分析和主成分分析区分墨旱莲的不同药用部位。

1 仪器与试药

Waters H-Class型超高液相色谱仪，Waters公司；HWS28型电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司；XP26型百万分之一电子天平、ME204E型万分之一电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；KQ500DE型数控超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；Milli-Q Direct型超纯水系统，默克股份有限公司。

11批墨旱莲药材样品经广东一方制药有限公司魏梅主任药师鉴定为菊科植物鳢肠L.的干燥地上部分，取部分药材挑选得到11批花、叶、茎部位，分别编号为H1～H11、Y1～Y11、J1～J11。产地信息见表1。

表1 11批墨旱莲药材产地信息

对照品咖啡酸（批号110885-201703，质量分数99.7%）、木犀草苷（批号111720-201609，质量分数94.9%）、4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸（批号111894-201102，质量分数94.1%）、蟛蜞菊内酯（批号111885-201403，质量分数99.6%），中国食品药品检定研究院；异绿原酸B 对照品（批号wkq19012301，质量分数98.97%），四川省维克奇生物科技有限公司；乙醇为分析纯，乙腈、三乙胺、磷酸均为色谱纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

选择Agilent SB C色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流速0.3 mL/min，流动相A 为乙腈、B 为0.53%磷酸溶液（含0.8%三乙胺），梯度洗脱（0～3 min，11%→16%A；3～9 min，16%A；9～20 min，16%→20%A；20～34 min，20%A；34～40 min，20%→80%A；40～41 min，80%→11%A；41～50 min，11%A），柱温30 ℃，检测波长330 nm，进样量1 μL。

2.2 对照品溶液制备

取咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、蟛蜞菊内酯对照品适量，置20 mL量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，配制成浓度分别为4.401、186.711、95.951、98.617、102.837 μg/mL 的混合对照品贮备液。分别精密量取对照品贮备液0.1、0.2、0.4、1、2 mL，置于10 mL量瓶中，用70%乙醇定容，得到系列浓度的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

取墨旱莲药材粉末（过3号筛）1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.4 特征图谱方法学考察

2.4.1 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，以蟛蜞菊内酯色谱峰为参照峰，计算得到各色谱峰相对保留时间RSD为0.03%～0.12%，相对峰面积RSD 为0.44%～1.75%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别于0、2、6、12、18、24 h进样测定，以蟛蜞菊内酯色谱峰为参照峰，计算得到供试品溶液各色谱峰相对保留时间RSD为0.10%～0.19%，相对峰面积RSD为0.34%～5.97%，除峰4外，色谱峰相对峰面积RSD为0.34%～2.36%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.3 重复性试验

取同一批号的墨旱莲样品6份，每份约1.0 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件测定，以蟛蜞菊内酯色谱峰为参照峰S，计算得到各色谱峰相对保留时间RSD为0.02%～0.19%，相对峰面积RSD为0.55%～1.92%，表明方法重复性良好。

2.5 特征图谱分析与评价

2.5.1 特征图谱建立及相似度评价

取11 批墨旱莲药材及其花、叶、茎样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）进行分析，结果见图1。选择成分已知、峰型和分离度较好、纯度较高的峰，确定9个共有峰。通过与对照品比对，指认5个色谱峰：1号峰为咖啡酸峰，2号峰为木犀草苷峰，3号峰为异绿原酸B峰，6号峰为4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸峰，9号峰为蟛蜞菊内酯峰，见图2。以峰型较好、峰面积较大的9号峰蟛蜞菊内酯峰为参照峰（S）。分别对11批墨旱莲药材及其花、叶、茎进行相似度评价，结果11批墨旱莲药材相似度为0.906～0.988，表明墨旱莲药材的整体质量比较稳定；11批花、叶、茎相似度分别为0.895～0.993、0.880～0.991、0.885～0.995，表明墨旱莲同一药用部位间相似度良好。见表2。

表2 11批墨旱莲药材及其花、叶、茎相似度评价

图1 11批墨旱莲药材及其花、叶、茎UPLC特征图谱共有峰

图2 墨旱莲药材及其花、叶、茎UPLC图

2.5.2 聚类分析

以9个色谱峰峰面积为数据，运用SPSS20.0软件，采用组间平均数连接法，以平方Euclidean 为度量标准，对墨旱莲药材及不同部位样品进行聚类分析，结果可将样品聚为三类（见图3），花、叶、茎各一类，药材在三类中均有分布。聚类分析可将花、茎、叶部位区分开，与指纹图谱相似度评价结果一致，表明墨旱莲不同药用部位存在明显差异。

图3 11批墨旱莲药材及其花、叶、茎样品聚类分析

2.5.3 主成分分析

对11批药材及花、叶、茎样品9个色谱峰峰面积数据处理后，采用SPSS20.0软件进行主成分分析。结果显示，主成分1、主成分2的特征值＞1，累计方差贡献率达77.925%（见表3），基本能体现原样品的信息。以主成分1、2为变量，得到二维投影图，在投影图中选取距离原点较远的几个点，权重值越大，该化合物在墨旱莲药材中的作用越大，见图4。分析可见，对主成分1产生较大影响的有峰1（咖啡酸）、峰3（异绿原酸B）、峰4、峰6（4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸），对主成分2影响较大的是峰7、峰8、峰9（蟛蜞菊内酯）。见表4。主成分得分散点图见图5，样品可分别聚成花、叶、茎（除J9）三类，与聚类分析结果基本一致。从主成分1轴分析，发现在此维度上叶与茎存在交叉（除个别样本J9、Y5），但花样本在该维度上都聚集在正值区域，远大于其余两类，可以实现墨旱莲花部位的区分。从主成分2轴分析，在此维度上花与茎交叉严重，个别叶样本（Y7、Y11）也存在交叉的情况，总体上叶样本在该维度大于其余两类，可实现叶样本的区分。因此，主成分1和主成分2可以作为墨旱莲花、叶及茎的分类识别变量，能够对墨旱莲药材的不同药用部位进行分类及质量评估。

表3 墨旱莲药材UPLC特征图谱色谱峰各主成分贡献率

图4 墨旱莲药材UPLC特征图谱色谱峰主成分分析二维投影

表4 11批墨旱莲药材及其花、叶、茎样品综合得分结果

图5 11批墨旱莲药材及其花、叶、茎样品主成分得分

2.6 5种成分含量测定

2.6.1 线性关系考察

取“2.2”项下系列混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，以对照品浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，进行回归处理，得各成分回归方程及线性范围，见表5。

表5 5种成分线性关系考察结果

2.6.2 加样回收率试验

取已知含量的墨旱莲药材（S4）约0.5 g，精密称定，平行称定6组，置具塞锥形瓶中，精密加入对照品混合溶液，按“2.3”项下方法制备并测定，计算加样回收率及RSD，结果见表6。表明该方法准确度良好。

表6 5种成分加样回收率试验结果

2.6.3 样品测定结果

取墨旱莲药材及其花、叶、茎样品，按“2.3”项下方法制备并测定，计算咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、蟛蜞菊内酯含量，结果见表7。墨旱莲不同药用部位的5种成分含量差异明显，花的平均总含量为9.71 mg/g，叶为6.69 mg/g，茎为1.19 mg/g，RSD为41.25%～115.12%。从成分含量均值看，咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸含量均为花＞叶，蟛蜞菊内酯含量花≈叶，茎的5种成分含量均低于同批次花和叶。可见，墨旱莲5种成分主要集中于花中，叶其次，茎中含量最低。

表7 墨旱莲药材及其不同药用部位5种成分含量测定结果（mg/g）

3 讨论

本研究对11批墨旱莲药材与花、叶、茎样品进行UPLC特征图谱分析，确定9个共有峰，指认了其中咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸和蟛蜞菊内酯5个特征峰；并对11批墨旱莲药材与花、叶、茎样品进行了相似度评价，结果显示，墨旱莲同一药用部位的相似度均在0.88以上，表明不同批次药材的同一药用部位相似度良好。共有峰峰面积聚类分析结果表明，墨旱莲不同部位UPLC特征图谱聚类分析可将花、茎、叶部位区分开，这与特征图谱相似度评价的结果一致。对共有峰进行主成分分析，将9个共有峰变量降维成2个主成分变量，可将样品分为三类，与相似度和聚类分析的结果一致。

墨旱莲传统采收经验是在花期采收其包括花、叶茎的地上部分。目前对墨旱莲的含量测定研究指标性成分大多只选择蟛蜞菊内酯作为单指标，未对墨旱莲的花、叶、茎部位进行分类研究。本研究选择咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、蟛蜞菊内酯5种指标成分对墨旱莲样品进行含量测定，分析更加严谨、全面。结果显示，墨旱莲花、叶和茎中5种成分含量差异明显，花部位平均总含量为9.71 mg/g，叶为6.69 mg/g，茎为1.19 mg/g，其中咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸含量均为花＞叶，蟛蜞菊内酯的含量花≈叶，而茎的5种成分含量均低于同批次的花和叶。综上，墨旱莲的各种成分主要集中于花中，叶其次，茎中几乎没有，花、叶、茎的比例对墨旱莲药材的质量有明显影响，与特征图谱分析结果相符。本方法同时测定墨旱莲5种成分含量及UPLC特征图谱，结合墨旱莲传统采收经验，可以实现对墨旱莲药材质量的合理控制。

本研究建立的墨旱莲药材及其花、叶、茎UPLC特征图谱准确度高、方法可靠、专属性强，可同时测定墨旱莲特征图谱和多个指标成分含量，为墨旱莲分析方法和化学成分研究提供参考，并为墨旱莲不同药用部位分析提供依据。