梁 杨 ,王小玲 ,郭 廷 ,郭礼强 ,李亚静

(1.迁安市中医医院,唐山 064400;2.中华人民共和国潍坊海关,潍坊 261041)

冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)简称冠心病,是一种严重威胁身体健康的疾病[1]。医师临床诊断隐匿性CHD 患者中,患者虽然冠脉血管狭窄,但多数无明确CHD 特征因素,如心电图、心肌酶谱均无异常,这对医师造成极大考验,易导致误诊或漏诊,需要通过检查冠脉CT 或冠脉造影来进一步确诊,费用高且属于有创检测。

不同程度CHD 病例临床表现不同,因此如何对疾病危险性进行有效评价至关重要。研究发现,血清甘氨酸水平降低与CHD 发生风险增加独立相关,并且不受糖尿病、高血压以及血脂紊乱等因素的干扰[2],为CHD 诊断带来新的思路。在心血管疾病患者中,色氨酸代谢异常会增加心血管疾病发生风险[3],血浆中色氨酸含量降低、犬尿氨酸(色氨酸代谢物)含量升高与病例死亡和心血管疾病风险增大显著相关[4-5]。通过对色氨酸及其代谢物进行定性定量分析可以更好地研究CHD 患者的病情,因此研究CHD 患者血液中氨基酸快速灵敏的检测方法,对医师诊断CHD 患者病情有重要的参考意义。

目前,血浆中多种氨基酸的检测方法主要有高效液相色谱法[6]、气相色谱-串联质谱法[7]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[1,5,8-14]。高效液相色谱法通量低,选择性差,灵敏度达不到要求。LCMS/MS方法选择性好,灵敏度高,检测周期短。目前,采用LC-MS/MS 来研究CHD 病例,已经有一定的工作基础,但多数文献更偏重于通过大量病例数据统计分析[5,8,10-11],而具体用什么条件的质谱方法来进行检测,方法的灵敏度和适用性如何并未展开讨论。在医学研究领域,准确定量血浆中的氨基酸十分关键,可以为医师诊断提供精准的数据支持。

本工作选择CHD 病例血浆为研究对象,结合Qu ECh ERS前处理提取方法,提出了快速测定血浆中14 种氨基酸的高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)。该方法灵敏度高、快速、稳定、可操作性强,只需单次提取净化就可以同时定性定量CHD 病例血浆中的14种氨基酸。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

LC2040/MS-8045型高效液相色谱-串联质谱仪;5810R 型离心机;Auto NE-8 型全自动氮吹仪;BYJ1-40L-AD 型超纯水机;MS3 型涡旋振荡器;ML 204型分析天平;24位水浴氮吹仪;30～300μL移液器。

单标准储备溶液:100μg·L－1,取适量的各氨基酸,用2%(体积分数,下同)甲酸溶液稀释,配制成质量浓度为100μg·L－1的单标准储备溶液,于4 ℃储存,存储期为6个月。

单标准溶液:取适量单标准储备溶液,分别用2%甲酸溶液稀释,配制成质量浓度为1μg·L－1的单标准溶液,现用现配。

混合标准溶液系列:取适量单标准溶液,混匀,用体积比80∶20的0.1%(体积分数)甲酸溶液-乙腈的混合液逐级稀释,配制成质量浓度分别为0.50,1.00,1.50,2.00,2.50,5.00,10.00,50.00,100.0,150.0,250.0,350.0μg·L－1的混合标准溶液系列,现用现配。

L-脯氨酸的纯度不小于99.3%;L-色氨酸和L-精氨酸的纯度均不小于99.2%;L-丙氨酸和甘氨酸的纯度均不小于99.8%;L-缬氨酸和D-天冬酰胺的纯度均不小于99.5%;L-苏氨酸的纯度不小于100.0%;DL-亮氨酸、L-酪氨酸和L-苯丙氨酸的纯度均不小于99.9%;L-异亮氨酸和L-犬尿氨酸的纯度均不小于98.0%;D-天冬氨酸的纯度不小于98.8%。

中性氧化铝;石墨化碳黑(GCB)、C18、N-丙基乙二胺(PSA)和氨丙基粉;甲醇、乙酸乙酯、乙腈和甲酸均为色谱纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

InertSustain AQ-C18色谱柱(100 mm ×2.1 mm,1.9μm);柱温35 ℃;进样体积5μL;流量0.3 mL·min－1;流动相A 为体积比900∶99∶1的水-乙腈-甲酸混合液,B为体积比999∶1的乙腈-甲酸混合液。梯度洗脱程序:0～5.0 min 时,B 由25%升至45%;5.0～7.0 min 时,B 由45%升 至85%,保持1.1 min;8.1～10.0 min时,B 由85%降至25%,保持2.0 min。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子(ESI)源,正离子(ESI＋)模式;碰撞气为氩气;加热气为空气,流量10 L·min－1;干燥气为氮气,流量10 L·min－1;雾化气为氮气,流量3 L·min－1;加热块温度400 ℃;脱溶剂管(DL)温度250 ℃;接口温度350℃;接口电压4 k V;多反应监测(MRM)扫描模式,最大扫描速率30 000 u·s－1。其他质谱参数见表1,其中“*”代表定量离子。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

1.3 试验方法

取抗凝后的血浆样品2 mL,置于10 mL 具塞离心管内,加入体积比89∶10∶1 的乙腈-水-甲酸混合液4 mL,涡旋30 s,于4 ℃以转速10 000 r·min－1离心10 min。转移上清液4 mL至20 mL干净玻璃试管中,加入200 mg C18和100 mg氨丙基粉,涡旋振荡1 min,静置分层后取2 mL 上清液于10 mL干净玻璃试管中,接着加入4 mL甲醇混匀,放入水浴氮吹仪中氮气吹至近干。残渣用0.5 mL体积比80∶20的1.5%(体积分数)甲酸溶液-乙腈的混合液溶解,振荡1 min,经0.22μm 双系滤膜过滤,滤液按照仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

氨基酸分子属于两性电解质,不同氨基酸结构、组成和化学性质有很大差异,如天冬氨酸等电点为2.98,精氨酸等电点为10.76。为提高质谱的离子化效率,参考文献[5,11],考察了甲酸和乙酸对14种氨基酸响应值的影响。结果发现,以甲酸溶液为水相时的质谱离子响应值比乙酸溶液为水相时提高80%以上。试验进一步考察了以体积分数分别为0.05%,0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.5%的甲酸溶液作为水相,以甲醇和乙腈分别作为有机相时对14种氨基酸响应值的影响。结果发现,乙腈为有机相时所得14种氨基酸响应值明显优于甲醇,在水相中添加一定比例乙腈,可以进一步提高14种氨基酸的稳定性,试验最终确定以体积比900∶99∶1的水-乙腈-甲酸混合液为水相,以体积比999∶1的乙腈-甲酸混合液为有机相。

试验考察了 ZORBAX Eclipse XDB-C18(100 mm×2.1 mm,3.5μm)、InertSustain AQ-C18(100 mm×2.1 mm,1.9μm)、ACQUITY UPLC HSS-C18(100 mm×2.1 mm,1.7μm)等3种色谱柱的分离效果。结果表明,InertSustain AQ-C18色谱柱所得检测周期更短、分离度更好。结合上述优化的流动相体系进行梯度洗脱,试验最终确定的色谱条件见1.2.1节。

2.2 质谱条件的优化

氨基酸分子结构中同时包含氨基及羧基,因此在ESI＋模式下[1,4,7]和负离子(ESI－)模式下[11]均能进行离子化。试验通过自动进样器将100μg·L－1单标准储备溶液单独直接注入ESI,分别在ESI＋、ESI－模式下扫描确定各氨基酸前体离子及产物离子,比较两种模式下14 种氨基酸的响应强度。结果表明,ESI＋模式下目标物的响应强度显著比ESI－模式高,在ESI＋模式下通过自动优化功能进一步优化各氨基酸前体离子、产物离子和碰撞能量,汇总最终优化的14种氨基酸的MRM 质谱参数见表1。在上述质谱条件下,MRM 模式下4.00μg·L－1混合标准溶液的提取离子色谱图见图1。

图1 提取离子色谱图Fig.1 Extracted ion chromatograms

2.3 提取净化条件的优化

提取溶剂主要有甲醇-水[15]、乙腈-水[2,9,14]和甲醇-乙腈[5],本试验结果表明,使用乙腈-水为提取溶剂时回收率较高,在提取溶剂中加入甲酸(甲酸体积占比为1%),回收率进一步提高了14.5%。人体血浆成分繁多,结构和基质复杂,试验考察了C18、PSA、中性氧化铝、氨丙基粉、GCB 等5 种常用Qu ECh ERS吸附剂[16-17]的净化效果,在20.00μg·L－1混合标准溶液中分别加入50 mg Qu ECh ERS吸附剂,处理后按照仪器工作条件测定,并计算14种氨基酸的回收率,结果见表2。

由表2可知,PSA、中性氧化铝和GCB 对部分氨基酸吸附严重,回收率偏低;吸附剂C18和氨丙基粉对14种氨基酸的净化效果较好,回收率分别为92.3%～105%和90.2%～103%,其中C18可以去除血浆中的色素和甾醇,氨丙基粉可去除血浆中的激素、糖以及某些极性较强的色素。综合考虑,为提高吸附剂的净化效果,试验最终选用C18和氨丙基粉为吸附剂。

表2 在不同吸附剂下14种氨基酸的回收率Tab.2 Recovery of 14 amino acids with different adsorbents

2.4 单标准储备溶液的配制溶剂的优化

文献[18-20]用0.1 mol·L－1盐酸溶液配制氨基酸标准溶液,但盐酸溶液属于强酸溶液,长期使用会腐蚀质谱离子源喷针、不锈钢管路,进而导致Cl－数据偏差。因此,试验分别以水、2%甲酸溶液和2%(体积分数,下同)乙酸溶液为溶剂配制单标准储备溶液,于4 ℃储存,每月定期检测,考察了单标准储备溶液的稳定性。结果表明:以水和2%乙酸溶液为配制溶剂时,存放6个月后各氨基酸含量平均下降15.7%和8.2%;而以2%甲酸溶液为配制溶剂时,存放6个月后各氨基酸含量无变化。因此,试验选用2%甲酸溶液为单标准储备溶液的配制溶剂。

2.5 标准曲线和测定下限

按照仪器工作条件测定混合标准溶液系列,以氨基酸的质量浓度为横坐标,对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。所得氨基酸的线性范围、线性回归方程和相关系数见表3。

按10倍信噪比(S/N)计算方法的测定下限(10S/N),结果见表3。

表3 线性参数和测定下限Tab.3 Linearity parameters and lower limits of determination

2.6 精密度及回收试验

在血浆基质中添加低、中、高等3个浓度水平的混合标准溶液,按照试验方法处理,每个浓度水平平行测定6次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表4。

由表4可知,14种氨基酸在3个浓度水平下的回收率为82.3%～102%,RSD 为3.3%～12%,符合GB/T 27404－2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》要求的准确度和精密度要求。

表4 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.7 样品分析

试验收集CHD 住院患者血浆21例(15例男性和6例女性,年龄在46～69岁内,即为患者组),健康受试者血浆12例(6例男性和6例女性,年龄在50～63岁内,即为对照组),经医院审核批准,受试者在采血前均已被告知本次研究目的和内容,并签署知情同意书,检测结果见表5。检测时稀释至线性范围内。

由表5可知,患者组数据中,脯氨酸、精氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的测定结果高于对照组数据,而其他氨基酸含量均不同程度降低,说明CHD 患者和健康人群相比,其体内氨基酸含量会因疾病产生变化。通过对比患者不同检测时期氨基酸含量的变化,以及和正常人群氨基酸含量的差异,从而对患者病情进行推断。文献[1]通过多元统计分析提出了预测CHD 的算法模型,方程式y＝1.483×ρ鸟氨酸/瓜氨酸－20.623,为CHD 疾病的诊断和预测提供了新的思路,本工作建立的方法为准确定性定量氨基酸、开展CHD 疾病预测课题研究提供技术支持。

表5 样品分析结果Tab.5 Analytical results of the samples

本工作借助QuEChERS 前处理净化技术,结合HPLC-MS/MS提出了快速测定CHD 患者血浆中14种氨基酸含量的方法。该方法准确、快速、简便、灵敏度高、实用性强,可以满足对CHD 患者血浆中氨基酸精准定量的检测要求,对医师判断、治疗管理和生理评估病情具有辅助诊断的意义。