薛 康 ,邓惠丹 ,刘睿佳 ,肖 宇 ,马 丽 ,张 格 ,陈艺峰,何嘉玲,何开蓉*,胡江涛

(1.成都海关技术中心,成都 610041;2.食品安全检测四川省重点实验室,成都 610041)

芬太尼类物质是一种合成的强效阿片类药物,主要用于麻醉,现已成为全球主要的临床麻醉药品,市场销售量在国内麻醉药品中居第2位,其镇痛效果是吗啡的100倍[1-2]。由于少量的芬太尼类物质和其他阿片类毒品混合就能达到亢奋的效果,大大降低了制毒成本,国家将芬太尼类物质指定为一类受控的新精神活性物质。

血液、尿液是芬太尼类物质定量分析的较常用的生物检材。目前针对生物检材中芬太尼类物质的分析可采用免疫分析法进行初步筛查和定性分析,也可采用分光光度法[3]、免疫分析法[4]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[5-6]、液相色谱串联质谱法(LCMS/MS)[7-10]进行定性定量分析。但这些方法中多数基于液液萃取前处理技术,基质效应明显,测定结果易受到干扰,而且仅能分离检测几种芬太尼类物质。而本工作采用固相萃取前处理技术,结合超高效液相色谱串联质谱法(UHPLC-MS/MS)对尿液和血液中15种芬太尼类物质的含量进行测定,旨在建立一种灵敏度高、操作性强的芬太尼类物质的检测方法,并应用于实际样品中。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

ACQUITY UPLC I-Class TQ-XS型超高效液相色谱-串联质谱仪;3H20RI型离心机;AE 240型电子天平;XW-80A 型涡旋混合器;B8510E-DTH型超声波清洗器;Mili-Q Integral 3 型超纯水仪;Waters Oasis MCX 固相萃取柱(3 mL/60 mg);0.22μm 有机滤膜;15 mL具塞塑料离心管。

混合标准溶液:1.0 mg·L－1,移取15 种芬太尼类物质的标准溶液适量,用甲醇稀释,配制成质量浓度为1.0 mg·L－1的混合标准溶液。使用时用甲醇稀释至所需质量浓度。

内标储备溶液:1.0 mg·L－1,移取适量的芬太尼-d5标准溶液,用甲醇稀释,配制成质量浓度为1.0 mg·L－1的内标储备溶液。

内标溶液:100μg·L－1,移取适量的内标储备溶液,用甲醇逐级稀释,配制成质量浓度为100μg·L－1的内标溶液。

对氟芬太尼、芬太尼、阿芬太尼盐酸盐、4-苯胺基-N-苯乙基哌啶、羟化去甲芬太尼、瑞芬太尼盐酸盐、卡芬太尼、丁酰芬太尼、呋喃芬太尼、去甲舒芬太尼、2,3-司可芬太尼,3-甲基硫代芬太尼、盐酸丙烯酰芬太尼、奥芬太尼等标准溶液的质量浓度均为100 mg·L－1;乙酰芬太尼标准溶液的质量浓度为50 mg·L－1;芬太尼-d5标准溶液的质量浓度为100 mg·L－1;甲醇、乙腈、乙酸铵和甲酸均为色谱纯;其他试剂均为分析纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(150 mm×2.1 mm,1.7μm),柱温35 ℃;流动相A 为含0.1%(体积分数,下同)甲酸的5 mmol·L－1乙酸铵缓冲溶液,B 为乙腈;流量0.25 mL·min－1;进样量1.0μL。梯度洗脱程序:0～4.0 min时,A 由90%降至75%,保 持1.0 min;5.0～10.0 min 时,A 由75%降至70%;10.0～13.0 min时,A 由70%降至55%;13.0～13.5 min 时,A 由55%跳转至5%;13.5～14.5 min 时,A 由5% 升至90%,保持1.5 min。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子(ESI)源,正离子(ESI＋)模式;脱溶剂气温度550℃,脱溶剂气流量1 000 L·h－1;多反应监测(MRM)模式;雾化气压力650 k Pa;毛细管电压2.83 k V。其他质谱参数见表1,其中“*”代表定量离子。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

表1 (续)

1.3 试验方法

取尿液或血液样品1.0 mL 于15 mL 离心管中,加 入100 μg·L－1内标溶 液100 μL 和0.1 mol·L－1盐酸溶液4 mL,振荡10 min,以转速8 000 r·min－1离心30 min,取上清液,待净化。分别用甲醇和水各2 mL 活化固相萃取柱,将提取的上清液过柱,用0.1 mol·L－1盐酸溶液2 mL 和甲醇2 mL淋洗固相萃取柱,最后用体积比5∶95的氨水-甲醇混合液3 mL 洗脱。收集洗脱液,氮吹至近干,残渣用 体积比9∶1 的 含0.1% 甲酸的5 mmol·L－1乙酸铵缓冲溶液-乙腈混合液(初始流动相)溶解并定容至1 mL,经0.22μm 有机滤膜过滤,滤液按照仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

试验考察了含0.1%甲酸的5 mmol·L－1乙酸铵缓冲溶液-乙腈、0.1%甲酸溶液-乙腈、含0.1%甲酸的5 mmol·L－1乙酸铵缓冲溶液-甲醇和0.1%甲酸溶液-甲醇等4组流动相体系的分离效果。结果表明:当以甲醇为有机相时,部分目标物色谱峰的分离度较差;当以乙腈为有机相,以0.1%甲酸溶液为水相时,检测出的目标物的响应强度相对较低;而以含0.1%甲酸的5 mmol·L－1乙酸铵缓冲溶液-乙腈为流动相时,15 种芬太尼类物质不仅分离效果较好,并且离子峰响应值也较高,峰形好。因此,试验选择以含0.1%甲酸的5 mmol·L－1乙酸铵缓冲溶液-乙腈为流动相。在优化的仪器工作条件下,混合标准溶液所得的总离子流色谱图见图1。

图1 总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram

2.2 质谱条件的选择

芬太尼类物质分子主要由苯烷基、哌啶基环和丙烷基酰胺等组成,其结构容易接受离子而被离子化,因此试验采用ESI＋模式和MRM 模式优化质谱参数。为了获得芬太尼类物质的最佳离子化效果,试验考察了以不同体积比的甲醇、乙腈、水和乙酸铵组成的溶剂的离子化效果,最终确定了以体积比9∶1的含0.1%甲酸的5 mmol·L－1乙酸铵缓冲溶液-乙腈混合液(即初始流动相)作为质谱进样溶剂。以100μg·L－1混合标准溶液直接进样分析,分别对15种芬太尼类物质进行一级质谱扫描和二级质谱扫描,为了得到相对丰度最高的准分子离子峰和子离子峰,对碰撞能量等参数进行优化,从而使离子信号达到较强的响应。优化的质谱条件见1.2.2节。

2.3 前处理方式的选择

芬太尼类物质常见的提取方式为液液萃取法,用乙酸乙酯、叔丁基甲醚或者正己烷提取胃容物、呕吐物等复杂基质的效果较差。试验采用净化效果更好的固相萃取法。在常用的几种固相萃取柱中,以阳离子交换混合机理的水可浸润型聚合物为基质的MCX 柱可提供双重保留模式(即离子交换和反相保留),其填料在pH 0～14内都很稳定,且有很大的结合容量,常用于提取净化需要高吸附量的生物基质(如血液、尿液、胆汁及组织匀浆)中的碱性化合物。因此,试验选择MCX 阳离子交换柱为固相萃取柱。试验中先用4 mL 0.1 mol·L－1盐酸溶液水解、沉淀尿液和血液样品中的蛋白质等杂质,再经高速离心后,上清液过MCX 固相萃取柱,将收集的洗脱液氮吹至近干,用初始流动相定容,过滤后检测,效果较好。具体的前处理过程见1.3节。

2.4 基质效应

基质效应(M i)是指样品中与目标物同时提取出来的物质引起的目标物分析信号抑制或增强的现象。M i值可按式(1)进行量化评估。

式中:M i为正值时,基质效应表现为增强效应,反之减弱。当M i的绝对值超过20%时,则认为基质效应对定量分析具有显著影响,不可忽略。样品中的各目标物经过本方法处理后,M i的绝对值均小于10%,说明该方法无明显的基质效应。各目标物具体的M i值见表2。

表2 基质效应Tab.2 Matrix effect

2.5 标准曲线、检出限和测定下限

移取适量混合标准溶液和内标溶液,用甲醇配制成质量浓度为0.5,1.0,5.0,10.0,20.0,50.0μg·L－1的混合标准溶液系列,其中内标芬太尼-d5的质量浓度为10.0μg·L－1。按照仪器工作条件测定,以目标物的质量浓度为横坐标,目标物与内标芬太尼-d5的峰面积比值为纵坐标,采用加权(权重系数为1/x)最小二乘法进行回归,求得线性回归方程及相关系数,结果见表3。

表3 线性参数Tab.3 Linearity parameters

结果表明,15种芬太尼类物质的线性范围均为0.5～50.0μg·L－1,相关系数均大于0.999 5。

以3倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N),以10倍信噪比计算测定下限(10S/N)。结果表明,尿液、血液样品中15种芬太尼类物质的检出限均为0.1μg·L－1,测定下限均为0.3μg·L－1。

2.6 精密度与回收试验

分别在空白尿液和血液样品中进行低(0.5μg·L－1)、中(25.0μg·L－1)、高(50.0μg·L－1)浓度水平的加标回收试验,计算回收率;同时每个浓度水平平行测定6次,连续进样6 d,计算测定值的相对标准偏差(RSD),得到日内精密度和日间精密度,结果见表4。

表4 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

表4 (续)

由表4可知,15 种芬太尼类物质的回收率为81.1%～113%,RSD 均小于15%,说明方法的回收率和精密度可以满足实际工作中的检测需求。

2.7 样品分析

按照试验方法分析6份不同来源的尿液和血液样品,结果显示15种芬太尼类物质均未检出。

本工作采用UHPLC-MS/MS同时测定尿液和血液样品中15种芬太尼类新精神活性物质,通过固相萃取技术对样品净化富集,芬太尼-d5作为内标定量,在16.0 min内完成了对各化合物的分析测定。该方法前处理简单、基质效应低、灵敏度高、选择性好,适用于实际样品的分析。但值得注意的是,芬太尼类新精神活性物质的结构以及代谢途径相似,许多芬太尼类物质有共同的代谢产物[11],这就使得鉴定结果的解释更为复杂,需要结合尿液和血液中的原药残留和代谢成分,才能更好地对鉴定结果进行解释。