李 强，李彩红，周 恒，乔 兵，刘建军，范礼斌

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)是一种早发的儿童恶性肿瘤，是由基因突变导致的[1]，基因分析表明RB的发生与RB1基因的突变有关[2]。RB1基因由27个外显子和26个内含子组成，定位于13q14上，全长178 143 bp， 编码序列(coding sequence，CDS)全长2 787 bp，编码928个氨基酸[3]。RB1基因编码的Rb蛋白含有3个结构域，即N端结构域、A/B口袋结构域和C端结构域[4]。Rb蛋白在细胞内磷酸化的程度与其生物学功能密切相关，例如低磷酸化或非磷酸化状态的Rb可与E2F1结合形成复合物，阻止E2F1转录因子的释放，使得E2F1介导的进入S期所必需的基因无法表达；而当Rb蛋白被CDK与周期蛋白复合物作用转变为超磷酸化状态时，Rb-E2F1复合物解离，释放的E2F1作为转录因子调控下游靶基因的表达[5]。此外，Rb蛋白在细胞的凋亡、染色质重塑等方面也有重要的作用[6]。已经发现在依托泊苷诱导的细胞凋亡过程中，Rb被caspase裂解，去除掉C端的42个氨基酸残基，产生一个100 ku的蛋白p100Rb[7]。在人骨肉瘤细胞Saos-2中也发现了一种突变的Rb蛋白p80Rb，其转录本与野生型Rb相比缺失了编码C端的21～27外显子[8]。目前尚无p100Rb和p80Rb相关生理功能的报道。为此，该研究构建了pcDNA3.1-p100Rb-FLAG和pcDNA3.1-p80Rb-FLAG真核表达载体，并过表达于HEK 293T细胞中，拟确定它们对细胞周期和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1质粒、菌株与细胞 pcDNA3.1-RB1-FLAG和pcDNA3.1真核表达载体、TG1菌株、HEK 293T细胞均为安徽医科大学生命科学学院范礼斌实验室自存，U2OS细胞购于中国科学院上海细胞库。

1.1.2主要仪器 Gelx-1620凝胶成像分析系统(上海欧翔科学仪器有限公司)；Axio Observer倒置荧光显微镜(德国Zeiss公司)；PTC-1148小型梯度PCR仪(上海伯乐生命医学产品有限公司)；……