冯真英,李嘉敏,吴春玲,叶少玲,陈文兴,刘芳芳

(1.广东医科大学附属第二医院,广东 湛江 524001;2.岭南师范学院,广东 湛江 524048)

市场上买卖的胡椒主要有黑胡椒和白胡椒,未成熟的胡椒果实经过水煮、干燥、发酵、烘干后,果皮酶变后呈黑色,称为黑胡椒;把胡椒成熟的果实在水中浸泡一个星期后,除种子外果皮、果肉等全部腐烂后脱落,洗净后仅剩下种子,将种子干燥后可得到白胡椒[1]。白胡椒中含有多种生物碱,主要包括:胡椒碱A、胡椒油碱B及C、胡椒林碱、胡椒新碱等[2]。胡椒碱在白胡椒所含生物碱中占比最大,是胡椒的主要活性成分,胡椒的辛辣味也大部分源于胡椒碱[3],白胡椒果实中胡椒碱含量最高,根次之,再到茎,叶中没有胡椒碱[4]。胡椒碱的分子式为C17H19NO3,相对分子质量为285.33[5],其结构式如图1所示。

图1 胡椒碱结构式

白胡椒可以用于治疗多种疾病,胡椒碱是白胡椒的主要有效成分,目前已知胡椒碱有抗氧化活性、抗肿瘤活性、抗抑郁活性,并且具有免疫调节、促进药物代谢、减少炎症的发生[6]及抗增殖[7]等作用。白胡椒中胡椒碱定量分析测定的主要方法有比色法、薄层紫外扫描法、紫外分光光度法[8-10],薄层紫外扫描法受到实验室现有的仪器的限制,比色法操作相对复杂,而紫外分光光度法操作简洁、快速,但是不够精准,《中华人民共和国药典》2020版规定可采用高效液相色谱法的方法测定胡椒碱中的含量,现在HPLC法越来越广泛地应用于药物分析中,在中药定量分析检测中具有简便、快速、高效、灵敏等优点,可为胡椒中胡椒碱含量测定提供有效的分析方法,现报道如下。

1 仪器和试药

1.1 仪器

实验中所需仪器型号及厂家见表1。

表1 主要仪器

1.2 试剂和药物

实验中所需试剂和药品见表2。

表2 主要试剂和药物

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液

用分析天平称取5.45mg胡椒碱对照品,置于棕褐色量瓶中,用体积分数为100%的乙醇溶解稀释,定容至25mL,摇匀即得对照品母液。用1 mL移液管精密量取对照品母液1 mL,置于10 mL棕褐色量瓶中,用无水乙醇定容,摇匀,即得浓度为21.8 μg/ mL的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液

取过60目筛的胡椒粉0.25 g 置于25 mL棕色容量瓶,加入4 mL 85%乙醇,轻微晃动置乙醇全部润湿胡椒粉,置于升温至85℃水浴锅中加热回流1 h,提取1次,抽滤旋干定容于25 mL棕色容量瓶中,用浓度为100%的乙醇溶解稀释,定容至刻度线处,摇匀,用1 mL移液管从25 mL棕色容量瓶中移取1 mL溶液加入到10 mL棕色容量瓶中,摇匀后,过0.45 μm微孔滤膜,即得。

2.2 色谱条件

色谱柱为KromasilC18色谱柱(4.6 mm × 250 mm× 5 μm);流动相是甲醇∶水(74∶26);流速是1 mL/min;紫外检测波长是343 nm;柱温箱温度为30℃;进样体积是20 μL。

2.3 系统适用性试验

吸取对照品溶液20 μL及供试品溶液20 μL,按2.2项下色谱条件进行测定。结果胡椒碱的理论板数大于5000,与相邻杂峰的分离度大于2.0,峰宽比较窄且为单一成分峰(见图2),保留时间在10 min以内,适合快速分析。

图2 HPLC色谱图A-对照品溶液,B-供试品溶液,1-胡椒碱

2.4 线性关系考察

精密吸取胡椒碱对照品溶液0.6、1.2、1.8、2.4、3.0、3.6 mL至容量为10 mL的棕色量瓶中,用无水乙醇稀释、定容并摇匀。吸取6份不同浓度的溶液各20 μL注入HPLC中,每一浓度测定三次。按照以上色谱条件测定峰面积,以峰面积作为Y轴(纵坐标),对照品浓度作为X轴(横坐标),绘制标准曲线,计算相关系数和回归方程。由表3可知,胡椒碱在13.08 ～78.48 μg/mL的浓范围内线性关系良好,线性方程为Y=156362X-67957。结果表明其相关程度高,能够反映峰面积与浓度的关系(见表3)。

表3 胡椒碱对照品溶液浓度与峰面积

2.5 精密度试验

精密吸取制作标准曲线中浓度为78.48 μg/mL对照品溶液20 μL,在相同的色谱条件下重复进样5次,分别测定其峰面积,计算得相对标准偏差为0.22%,小于0.3%,说明仪器的精密性良好(见表4)。

表4 精密度试验

2.6 重复性试验

按供试品溶液制备的方法,共平行制备5份,进样20 μL,依法测定峰面积值,结果RSD=3.35%,表明此法重现性较好(见表5)。

表5 重复性试验

2.7 稳定性试验

取一供试品溶液,分别于0、2、4、6、8小时进样测定,结果RSD=4.95%。小于5%,说明该样品的稳定性良好(见表6)。

表6 稳定性试验

2.8 加样回收试验

取5个10 mL棕色容量瓶,精确移取己知含量的重复性试验第5份供试品溶液1 mL,然后从浓度为78.48 μg/mL对照品溶液中移取2.7 mL、2.7 mL溶液,分别置于第一、二号瓶中,从浓度为65.4 μg/mL对照品溶液中移取3.0 mL、2.55 mL溶液,分别置于第三、四号瓶中,从浓度为52.32 μg/mL对照品溶液中移取3.1 mL、3.2 mL溶液,分别置于第五、六号瓶中,按供试品制备测定加样回收率,结果显示用胡椒碱做外标测量胡椒碱含量时,RSD为2.46%,说明胡椒碱稳定,胡椒碱少与其他物质反应(见表7)。

表7 胡椒中胡椒碱加样回收率

2.9 样品含量测定

取白胡椒约1 g,精密称定,按“2.1.2”项下方法进行处理,按“2.2”项下色谱条件测定,记录胡椒碱的峰面积并按以下公式计算其含量:胡椒碱含量=(峰面积+67957)×稀释倍数÷(156372×106×称量质量)×100%,最后得出白胡椒中胡椒碱的含量为3.4%。

3 讨论

3.1 指标成分选择

胡椒碱具有十分丰富的药理活性,本文选用胡椒碱含量为指标,测定白胡椒中的含量,有利于科学评价白胡椒的药用价值及质量,为白胡椒的进一步研究分析提供技术支撑。本文采用的色谱条件,分离效果好,方法简捷可靠,可用于胡椒碱的含量测定及控制白胡椒的质量。稳定性试验中RSD为4.95%,数值较大,说明胡椒碱的稳定性较差,要现提现测,缩短提取及检测时间,提高试验数据的可靠性。

3.2 流动相条件选择

分析比较实验所得数据可知,流动相比例为甲醇∶超纯水=66∶34时,保留时间过长;综合比较其余三组,最终确定色谱条件如下:KromasilC18色谱柱(4.6 mm × 250 mm,5 μm);流动相∶甲醇-水(74∶26);流速:1 mL/min;检测波长343 nm,柱温:30℃;在上述色谱条件下,胡椒碱的保留时间为8.87 min,适合快速分析。

3.3 提取工艺的选择

白胡椒中提取胡椒碱试验影响最显著的几个因素是料液比、提取温度、提取时间、乙醇体积分数,确定影响因素后,先后进行单因素考察,以胡椒碱提取率为指标,考察每一因素对胡椒碱提取率影响大小,通过实验得出,白胡椒醇提胡椒碱实验中,对胡椒碱提取率影响最显著的几个因素及影响因素显著大小顺序为:提取温度>乙醇体积分数>料液比>提取时间,后经过正交试验、验证试验得出白胡椒中提取胡椒碱的最优提取工艺为提取温度85℃、料液比1∶16、乙醇体积分数85%、提取时间1 h。

3.4 建立含量测定的意义

现代药理学研究表明,胡椒碱具备抗癌、抗氧化、抗菌、抗炎、降糖、抗抑郁等广泛的生物活性[11]。本试验建立了白胡椒中胡椒碱的高效液相色谱的含量测定方法,以此进一步科学、系统开发白胡椒中胡椒碱的成分的提取纯化,为其合理利用和临床应用提供科学依据。

本实验利用外标的HPLC测定海南产白胡椒中胡椒碱的含量,经过稳定性等方法学考察,证实该方法是可行的,在该条件下所测得的白胡椒中胡椒碱的含量为3.2%。