贾光辉，丁一冰，赵永强，高增润

（内蒙古乌兰察布市中心医院普通外科，内蒙古乌兰察布012000）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC） 是临床常见的消化道恶性肿瘤，也是我国肿瘤发病率上升最快的肿瘤之一[1]。虽然不断有新的方法应用于临床，但是结直肠癌患者的5年生存率仍不足30%，分析结直肠癌发生和进展的机制对于临床诊断和治疗具有重要意义[2]。TGF-β 通路是促进结直肠癌发生和转移的重要通路，SMAD4 蛋白是该通路的下游终点蛋白，其可通过促进促癌因子的转录进而参与结直肠癌的发生和发展[3]，若SMAD4 蛋白的表达水平被抑制，则TGF-β 通路就会被阻断[4]。Runt 相关转 录因子3 （Runt-related transcription factor 3，RUNX3） 是一种参与上皮细胞发育的转录因子，其参与调节了多种促癌或者抑癌基因的转录[5]。临床研究显示结直肠癌组织中RUNX3 蛋白的表达水平显著降低，提示其抑癌作用[6]，但是抑制结直肠癌的机制是否与TGF-β/SMAD4 通路有关仍不清楚。综上，本文主要分析RUNX3 和SMAD4 参与结直肠癌的发生发展的机制，以期为结直肠癌的进一步研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 临床标本

收集2019年6月—2021年6月间内蒙古乌兰察布市中心医院普通外科收治的原发性结直肠癌患者临床及病理资料、患者肿瘤组织或者癌旁正常组织（距离肿瘤外缘>3 cm），在-80 ℃下保存。纳入标准：⑴年龄在40~65 岁之间；⑵经过组织学检验确诊为结直肠癌；⑶知情同意。排除标准：⑴组织收集前3个月内接受过抗肿瘤相关治疗；⑵合并其他恶性肿瘤、血液学疾病、感染或其他炎症；⑶合并其他消化道疾病。本研究经内蒙古乌兰察布市中心医院伦理委员会的批准[2020-11]。最终纳入患者98例，其中男52例，女46例；年龄41~65 岁，平均（49.42±3.71）岁。

1.2 主要实验材料

人结直肠癌细胞系SW480 （ATCC 公司，美国）。DMEM 培养基血清和抗体（Invitrogen 公司，美国）。TRIzol 和M-MLV 逆转录酶（Invitrogen，美国）。One-Step qRT-PCR Kit 试剂盒（北京CWBIO 公司，美国）。RUNX3 和SMAD4 过表达质粒，以及阴性对照（NC） 质粒（GenePharma 公司，中国）。LipofectamineTM2000 （Sigma-Aldrich 公司，美国）。RUNX3 抗体（Abcam 公司，美国）。PVDF 膜（Bio-Rad 公司，美国）。

1.3 细胞处理

SW480 细胞均培养在DMEM 完全培养基中，培养基含有10%的胎牛血清、0.1 mg/mL 的链霉素和100 U/mL 的青霉素。将细胞在5% CO2培养箱中于37 ℃和95%湿度下培养。

将细胞分为对照组、RUNX3 组、SMAD4 组和RUNX3+SMAD4 组。通过转染，过表达RUNX3 和（或）SMAD4。细胞在6 孔板中培养，当细胞达到60%汇合后，添加Opti （100 μL） 和LipofectamineTM2000（5 μL）并孵育5 min 作为试剂A。加 入Opti （100 μL） 和RUNX3 和/或SMAD4 质粒（20 ng/μL）并孵育5 min 作为试剂B。将A 和B混合在一起并孵育20 min。16 h 后，更换培养基并收获细胞。通过转染等量的阴性对照质粒作为对照。

1.4 检测方法

1.4.1 Western blot 组织样本或者细胞研磨后裂解，通过离心（4 ℃，12 000 r/min，5 min） 收集总蛋白。通过8%的SDS-PAGE 分离每个样品中等量（50 μg）的蛋白质，并将其转移到PVDF 膜上。利用脱脂牛奶（5%，2 h）进行封闭。随后，将膜与1∶800 稀释的RUNX3 或 者SMAD4 抗体 在4 ℃下孵育过夜，然后将膜与相应的二抗在室温下孵育1 h。使用化学发光试剂显示，使用Quantum One 软件分析灰度计算RUNX3 和SMAD4 蛋白相对于GAPDH 的表达量。

1.4.2 qRT-PCR TRIzol 被用于提取组织或者细胞中总RNA，使用M-MLV 逆转录酶将RNA 合成互补DNA，然后通过One-Step qRT-PCR Kit 试剂盒进行逆转录，共进行40个循环：95 ℃30 s、95 ℃5 s和60 ℃30 s。内参为GAPDH，通过2-ΔΔCt计算SMAD4 mRNA 的相对表达水平。

1.4.3 CCK-8 实验检测细胞增殖活力 将100 μL 的细胞悬浮液添加到96 孔板的孔中，孵育48 h 和72 h 后，将体积为10 μL 的CCK-8 溶液添加到每个孔中并孵育2 h。在450 nm 波长下，用酶标仪检测每个孔的光密度（OD）值。

1.4.4 Transwell 实验检测侵袭 在37 ℃下将细胞培养在无血清DMEM 中将细胞（5×104细胞/mL）进行血清饥饿处理24 h。然后将细胞接种到24 孔Transwell 装置的上部腔室中，将含有15%胎牛血清的DMEM 充满下部腔室。24 h 后，清洗掉未侵入的细胞，并将渗透到下腔室中的细胞用95%乙醇固定，并在室温下用0.1%结晶紫染色20 min。

1.5 统计学处理

设立3个平行实验。使用SPSS 19.0 进行统计，数据以平均值±标准差（±s），多组间比较使用方差检验，两两比较采用t检验。Pearson 检验用于分析RUNX3 与SMAD4 的相关性。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 RUNX3 与SMAD4 在结直肠癌组织中的表达特点

结直肠癌组织中的RUNX3 蛋白表达明显低于癌旁正常组织（P<0.05），而SMAD4 mRNA 和蛋白表达均明显高于癌旁正常组织（均P<0.05）。结直肠癌组织中RUNX3 蛋白分别与SMAD4 mRNA 和蛋白表达水平呈负相关（r=0.511，P=0.004；r=0.487，P=0.009）（图1）（表1）。

图1 Western blot检测结直肠癌组织与癌旁组织RUNX3和SMAD4蛋白表达Figure 1 Western blot detection of RUNX3 and SMAD4 protein expressions in colorectal cancer and adjacent tissues

表1 RUNX3 蛋白与SMAD4 mRNA 和蛋白的相对表达量（± s）Table 1 The relative expression levels of RUNX3 protein and SMAD4 mRNA and protein(± s)

表1 RUNX3 蛋白与SMAD4 mRNA 和蛋白的相对表达量（± s）Table 1 The relative expression levels of RUNX3 protein and SMAD4 mRNA and protein(± s)

注：1）与癌旁正常组织比较，P<0.05Notes：1)P<0.05 vs.normal tissue adjacent to cancer

images/BZ_87_213_3050_470_3107.pngimages/BZ_87_470_3050_703_3107.pngimages/BZ_87_703_3050_936_3107.png组别癌旁正常组织结直肠癌组织RUNX3 1.00±0.18 0.31±0.051）SMAD4 mRNA 1.00±0.15 4.12±0.671）SMAD4蛋白1.00±0.15 3.34±0.521）

2.2 转染后各组细胞中RUNX3、SMAD4 mRNA 和蛋白的表达水平

与对照组比较，RUNX3 组的RUNX3 蛋白水平均明显升高，但SMAD4 mRNA 和蛋白水平明显降低（均P<0.05）；SMAD4 组的SMAD4 mRNA 和蛋白的表达水平明显升高（均P<0.05），但RUNX3 蛋白水平无明显变化（P>0.05）；RUNX3+SMAD4 组的RUNX3蛋白水平均明显升高（P<0.05），SMAD4 mRNA 和蛋白水平变化不明显（均P>0.05）（图2）（表2）。

图2 Western blot 检测各组细胞中RUNX3 与SMAD4 蛋白的表达Figure 2 Western blot detection of the RUNX3 and SMAD4 protein expressions in each group of cells

表2 各组细胞中RUNX3蛋白、SMAD4 mRNA和蛋白相对表达量（± s）Table 2 The relative expression levels of RUNX3 protein and SMAD4 mRNA and protein in each group of cells(± s)

表2 各组细胞中RUNX3蛋白、SMAD4 mRNA和蛋白相对表达量（± s）Table 2 The relative expression levels of RUNX3 protein and SMAD4 mRNA and protein in each group of cells(± s)

注：1）与对照组比较，P<0.05；2）与SMAD4 组比较，P<0.05；3）与RUNX3组比较，P<0.05Notes：1) P<0.05 vs. control group; 2) P<0.05 vs. SMAD4 group;3)P<0.05 vs.RUNX3 group

images/BZ_87_1288_2168_1593_2225.pngimages/BZ_87_1288_2282_1593_2339.pngimages/BZ_87_1593_2168_1807_2225.pngimages/BZ_87_1593_2282_1807_2339.pngimages/BZ_87_1807_2168_2052_2225.pngimages/BZ_87_1807_2282_2052_2339.png组别对照组RUNX3组SMAD4组RUNX3+SMAD4组RUNX3蛋白1.00±0.08 3.92±0.361）1.03±0.07 3.98±0.351），2）SMAD4 mRNA 1.00±0.07 0.21±0.021）3.56±0.311）1.03±0.092），3）SMAD4蛋白1.00±0.06 0.24±0.021）3.24±0.281）0.96±0.082），3）

2.3 RUNX3 和SMAD4 对结直肠癌细胞增殖的影响

各组细胞增殖能力差异有统计学意义（P<0.05）。RUNX3 组细胞增殖能力明显低于对照组（P<0.05），SMAD4 组的细胞增殖能力明显高于对照组（P<0.05），RUNX3+SMAD4 组的细胞增殖能力明显高于RUNX3 组，但明显低于SMAD4 组（P<0.05），与对照组间无明显差异（P>0.05）（表3）。

表3 RUNX3和SMAD4对结直肠癌细胞增殖的影响（± s）Table 3 Effects of RUNX3 and SMAD4 on the proliferation of colorectal cancer cells(± s)

表3 RUNX3和SMAD4对结直肠癌细胞增殖的影响（± s）Table 3 Effects of RUNX3 and SMAD4 on the proliferation of colorectal cancer cells(± s)

注：1）与对照组比较，P<0.05；2）与RUNX3 组比较，P<0.05；3）与SMAD4组比较，P<0.05Notes：1) P<0.05 vs. control group; 2) P<0.05 vs. RUNX3 group;3) P<0.05 vs.SMAD4 group

images/BZ_88_213_572_599_629.pngimages/BZ_88_213_686_599_743.pngimages/BZ_88_599_572_896_629.pngimages/BZ_88_599_686_896_743.png组别对照组RUNX3组SMAD4组RUNX3+SMAD4组48 h 0.67±0.05 0.55±0.061）0.79±0.081）0.69±0.082），3）72 h 1.20±0.10 0.97±0.111）1.39±0.121）1.25±0.112），3）

2.4 RUNX3 和SMAD4 对结直肠癌细胞侵袭的影响

各组细胞侵袭能力差异有统计学意义（P<0.05）。RUNX3 组细胞侵袭能力明显低于对照组（P<0.05），SMAD4 组的细胞侵袭能力明显高于对照组（P<0.05），RUNX3+SMAD4 组的细胞侵袭能力明显高于RUNX3 组，但明显低于SMAD4 组（均P<0.05），与对照组间无明显差异（P>0.05）（表4）（图3）。

表4 各组结直肠癌细胞侵袭细胞数的影响（± s）Table 4 Number of the invaded cells of each group(± s)

表4 各组结直肠癌细胞侵袭细胞数的影响（± s）Table 4 Number of the invaded cells of each group(± s)

注：1）与对照组比较，P<0.05；2）与RUNX3 组比较，P<0.05；3）与SMAD4组比较，P<0.05Notes：1) P<0.05 vs. control group; 2) P<0.05 vs. RUNX3 group;3) P<0.05 vs.SMAD4 group

images/BZ_88_1288_892_1742_949.pngimages/BZ_88_1288_1006_1742_1063.png组别对照组RUNX3组SMAD4组RUNX3+SMAD4组侵袭细胞数目（个）58.34±2.06 24.15±1.421）127.36±3.851）55.37±2.572），3）

图3 Transwell检测各组细胞的侵袭能力 A：对照组；B：RUNX3组；C:SMAD4组；D：RUNX3+SMAD4组Figure 3 Invasion ability of each group of cells detected by Transwell assay A: Control group; B: RUNX3 group;C:SMAD4group;D:RUNX3+SMAD4 group

3 讨 论

结直肠癌以40~50 岁年龄段发病率最高[7-8]。尽管近年来检测方法、放疗、化疗和内镜技术得到了长足的发展，但结直肠癌的5年生存率仍然较差[9-10]。研究结直肠癌相关基因的调控机制具有重大现实意义。本研究旨在讨论RUNX3 与TGF-β/SMAD4 信号通路的关系，以及RUNX3 在结直肠癌发展中的作用机制。

RUNX3 蛋白是一种转录因子，研究[11-12]表明其可与许多增强子和启动子的核心位点5'-PYG PYG GT-3'结合，从而促进或抑制基因的转录水平。RUNX3 在多种肿瘤中发挥抑癌作用，如胰腺癌[13-14]、食道癌[15-16]、肾癌等[17-18]。最近研究也显示RUNX3 也与结直肠癌有关，如Li 等[19]的研究显示RUNX3 基因结直肠癌组织中显著下调，并且与结直肠癌的分期和转移有关。此外，也有研究[20]显示RUNX3 通过上调结直肠癌中的DR5 增强TRAIL 诱导的细胞凋亡。本研究收集了98例结直肠癌组织和癌旁正常组织，通过Western blot 实验发现RUNX3 蛋白在结直肠癌组织低表达。通过细胞实验构建了RUNX3 过表达的结直肠癌细胞模型，发现RUNX3 蛋白升高会抑制结肠癌细胞的增殖和侵袭，RUNX3 的降低与结直肠癌发生和发展有关，提高RUNX3 则会抑制结直肠癌细胞的增殖和侵袭。

为进一步分析RUNX3 抑制结直肠癌的机制，本研究也检测了TGF-β 信号通路中SMAD4 的水平。SMAD4 是TGF-β 信号的终点蛋白，TGF-β 信号通路的激活会最终引起SMAD4 蛋白的功能激活，而直接抑制SMAD4 蛋白的表达水平则可从根本上阻断TGF-β 信号通路[21-23]。SMAD4 是一种促癌蛋白，研究显[24-25]示在结直肠癌中，SMAD4 显著高表达，且与结直肠癌患者的恶性病理特点和不良预后有关。体外研究[26]也证实了提高SMAD4 的表达会促进结直肠癌细胞的增殖和侵袭。本研究结果显示，结直肠癌组织中的SMAD4 mRNA 和蛋白水平显著高于癌旁正常组织，且SMAD4 mRNA 和蛋白水平均与RUNX3 蛋白负相关，这提示RUNX3 可能负调控SMAD4 的转录和蛋白表达。为进一步验证这一推测，本研究利用结直肠癌细胞构建了RUNX3 和（或）SMAD4 过表达的细胞模型，结果显示过表达RUNX3 会抑制SMAD4 mRNA 和蛋白的水平；而过表达SMAD4 不仅显著促进结直肠癌细胞的增殖和侵袭，还会显著的削弱RUNX3 对结直肠癌细胞的抑制作用。在另一种消化系统肿瘤—胰腺癌相关研究[27-29]中也显示，RUNX3 与SMAD4 的表达水平负相关，且与不良预后有关。肾癌相关研究[30]亦显示，可通过微小RNA-93 抑制RUNX3 蛋白的表达，从而抑制SMAD4 的表达，提高细胞的增殖和转移能力。结合既往文献与本研究结果，推测结直肠癌中RUNX3 蛋白的降低会导致SMAD4 转录和蛋白表达水平的升高，从而参与结直肠癌的发生和发展。

然而，本研究也有一定的局限性，关于RUNX3 和SMAD4 与结直肠癌患者预后的关系仍需要扩大样本，延长随访时间进行分析；RUNX3 通过调控SMAD4 抑制结直肠癌发生和发展的作用机制仍需行体内实验验证。

综上所述，RUNX3 可通过抑制SMAD4 抑制结直肠癌的发生和发展，提示RUNX3 可能成为诊断和治疗结直肠癌的新靶点。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。