张捷平，林晓晖，陈 勇，郑燕芳，庄舒婷，江继超，施 红*

（1.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

法尼醇X受体（farnesoid X receptor，FXR）是核激素受体超家族成员，主要表达于肝、肠、肾等组织器官，因胆汁酸是其内源性天然配体，故又称为胆汁酸受体［1］。在肝内，胆汁酸合成通过2条途径实现，经典途径是胆汁酸合成的主要途径，由关键酶胆固醇-7α-羟化酶（cholesterol 7 alpha-hydroxylase，CYP7A1）催化；替代途径则由甾醇27α羟化酶（sterol 27α-hydroxylase，CYP27A1）、甾醇12α羟化酶（sterol 12αhydroxylase，CYP7B1）介导。近来大量研究显示：FXR激活后具有多种生物学效应，不仅参与抑制胆汁酸的合成，而且能促进糖脂代谢［2］。因此FXR被认为是防治胆汁淤积性肝病、肥胖、2型糖尿病等代谢性疾病的重要靶点。本课题组前期临床与基础研究表明：石斛合剂能有效降低2型糖尿病患者及模型动物的血糖，改善高脂血症，缓解胰岛素抵抗状态［3-7］。本研究以糖尿病模型db/db小鼠为对象，观察石斛合剂对db/db小鼠肝脏FXR和CYP27A1蛋白表达及脂代谢指标的影响，以探讨其调节胆汁酸代谢与脂代谢的可能机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 7周龄SPF级糖尿病模型的db/db雄性小鼠20只，体质量22～28 g和7周龄SPF级db/m雄性小鼠10只，体质量18～23 g均购自常州卡文斯实验动物有限公司，合格证号：SCXK（苏）2016-0010，饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF级动物饲养室，许可证号：SYXK（闽）2019-0007。本实验方案经福建中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准文号：FJTCM IACUC 2021078）。

1.2 主要药品与试剂 石斛合剂（组成：石斛15 g，知母10 g，黄芪20 g，丹参15 g，葛根10 g，黄连6 g，五味子10 g，地龙9 g，蒲公英15 g，大黄3 g）中药饮片均购自福建中医药大学附属第三人民医院；葡萄糖（FBG）检测试剂盒（批号：20210915）、糖化血清蛋白（GSP）检测试剂盒（批号：20210915）、总胆固醇（TC）检测试剂盒（批号：20210916）、三酯甘油（TG）检测试剂盒（批号：20210916）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）检测试剂盒（批号：20210916）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）检测试剂盒（批号：20210916）和总胆汁酸（BA）检测试剂盒（批号：20210917）均购自南京建成生物技术有限公司；FXR抗体（货号：72105）、β-actin抗体（货号：3700）均购自美国Cell Signal Technology公司；CYP7A1抗体（美国abcam公司，货号：ab234982）。

1.3 主要仪器设备 INFINITE 200 PRO型酶标仪（奥地利Tecan公司）；DU730型核酸-蛋白分析仪（美国BACKMAN公司）；Mini Protean垂直电泳-转印装置、化学发光显像仪均购自美国Bio-Rad公司。

2 实验方法

2.1 石斛合剂制备 将石斛合剂中药饮片用2倍体积蒸馏水浸泡0.5 h，文火煎煮2 h，过滤浓缩，调整至含生药量2 g/mL，灭菌后置于4℃备用。

2.2 动物分组及给药 适应性喂养1周后，以随机数字表法将20只db/db小鼠分为模型组、中药组，每组10只，将10只db/m小鼠设为正常组。中药组按照临床等效剂量换算，按10 mL/（kg·d）灌服2 g/mL石斛合剂；正常组和模型组小鼠灌服与中药组等体积的生理盐水。3组均每天2次，连续灌服4周。

2.3 标本采集 给药结束后24 h，小鼠禁食不禁水8 h，以0.3%戊巴比妥钠按50 mg/kg腹腔注射麻醉，眼部采集血液，分离血清于-80℃冰箱保存，用于血清学指标检测。然后脱颈处死小鼠，解剖取3组每只小鼠肝脏右侧肝叶切分为2份，1份置于4%多聚甲醛固定，用于肝组织病理形态学观察，1份存储于-80℃冰箱，用于检测蛋白相对表达量。

2.4 观察指标及检测方法

2.4.1 FBG与GSP检测 FBG监测采用葡萄糖氧化酶法，GSP检测采用果糖胺法。

2.4.2 血清TC、TG、LDL-C、HDL-C和BA检测 均采用以酶法检测。

2.4.3 肝组织病理形态学观察 肝组织用4%多聚甲醛溶液固定24 h后，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，予以苏木素-伊红染色（HE染色），光镜下观察肝脏病理形态学改变。

2.4.4 Western blot检测肝组织FXR和CYP7A1相对蛋白表达量 随机抽选各组5份标本，称取约100 mg肝组织样品加入1 mL RIPA细胞裂解液（含PMSF）冰上匀浆，在4℃条件下，以12 000 rpm离心15 min，取上清即为肝组织总蛋白，用BCA法测定提取液的总蛋白浓度，然后加入5×Loading Buffer，沸水浴10 min使蛋白变性；取30μg蛋白，经10%SDS-PAGE电泳分离，湿法电转移至PVDF膜，10%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入抗FXR（1∶1 000）、抗CYP7A1（1∶1 000）和抗β-actin（1∶3 000），4℃摇动孵育过夜，洗膜后加二抗室温孵育2 h，化学发光，Bio-Rad成像系统对蛋白条带进行成像。以ImageJ凝胶图像软件检测相应区带的光密度值（IA）。以IA目的蛋白/IAβ-actin结果表示目的蛋白质的相对表达量。

2.5 统计学方法 采用SPSS 23.0软件进行统计分析。计量资料属正态分布的以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验。

3 结 果

3.1 3组小鼠血清FBG和GSP比较 见表1。

表1 3组小鼠血清FBG和GSP比较（±s） mmol/L

表1 3组小鼠血清FBG和GSP比较（±s） mmol/L

注：与正常组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。

组别正常组模型组中药组n 10 10 10 FBG 5.31±0.28 20.58±3.261）12.67±2.351）2）GSP 1.89±0.18 3.58±0.311）2.68±0.321）2）

3.2 3组小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C和BA比较 见表2。

表2 3组小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C和BA比较（±s）

表2 3组小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C和BA比较（±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。

组别正常组模型组中药组n 10 10 10 TC/（mmol/L）3.86±0.30 9.15±0.621）5.61±0.491）2）TG/（mmol/L）1.13±0.21 3.78±0.461）2.37±0.321）2）LDL-C/（mmol/L）2.04±0.18 6.15±0.441）3.95±0.411）2）HDL-C/（mmol/L）1.92±0.12 1.45±0.161）1.78±0.211）2）BA/（μmol/L）35.80±2.68 95.85±7.561）56.63±5.131）2）

3.3 3组小鼠肝组织病理形态学比较 光镜下可见，正常组肝细胞排列整齐，肝小叶清晰，无明显脂肪样变性的细胞；模型组肝细胞排列不规则，肝小叶的边界不清，可见大量玻璃样、气球样性改变细胞，累及肝小叶约1/2；中药组肝细胞排列较整齐，肝小叶结构较清晰，可见少量气球样改变的肝细胞，并以小空泡为主，累及肝小叶约1/3。见图1。

图1 3组小鼠肝组织病理形态学HE染色图（×200）

3.4 3组小鼠肝组织FXR和CYP7A1相对蛋白表达量比较 见图2。

图2 3组小鼠肝组织FXR和CYP7A1相对蛋白表达量比较

4 讨 论

糖尿病属于中医“消渴”范畴。饮食、劳欲、禀赋、情志等因素失衡，均可导致人体气机郁结，积热伤阴化燥，出现“消渴”。痰、热、瘀、毒等是糖尿病常见的病理因素，本课题组以滋阴清热、化瘀解毒为治疗原则，运用清热活血祛毒方石斛合剂治疗糖尿病及其并发症，取得较好疗效。方中石斛、知母滋阴润燥，壮水制火；黄芪补脾肺之气；丹参活血祛瘀；黄连清热利湿；五味子、葛根敛肺滋肾生津；地龙通经活络；蒲公英利湿清热；大黄泻热逐瘀。

高脂血症、肝脂肪变等是糖尿病常见临床并发症［8］。肝生成的胆汁酸作为乳化剂，能促进食物脂质的消化与吸收，对高脂血症与脂肪肝的发生有重要影响［9］。在胆汁酸生成的经典途径过程中，CYP7A1是胆汁酸转化的限速酶，受FXR介导信号通路调控。当肝细胞质内FXR与配体结合，能激活下游小异二聚体伴侣，诱导肝受体同源物l及肝核受体4α形成复合物，结合到CYP7A1基因调控序列从而抑制基因表达，减少胆汁酸生成；反之，当FXR信号被抑制时，则促进胆汁酸生成［10］。

db/db小鼠是由于4号染色体的瘦素受体基因突变所引起的2型糖尿病模型动物，目前广泛应用于2型糖尿病及并发症的实验研究［11-12］。在本实验中，模型组db/db小鼠与正常组比较，肝FXR相对蛋白表达量下降，CYP7A1相对蛋白表达量增加，血BA含量增加，这可能是TC、TG、LDL-C升高与肝细胞脂肪样变性的重要原因之一。经过4周石斛合剂的治疗，与模型组比较，中药组小鼠肝FXR相对蛋白表达量显著增加，CYP7A1相对蛋白表达量减少，血BA含量下降，使TC、TG、LDL-C明显下降，肝细胞脂肪样变性减少。结果表明石斛合剂可能通过增加db/db小鼠肝FXR蛋白表达，抑制CYP7A1蛋白表达，减少BA生成，从而改善糖尿病模型小鼠的血脂紊乱，减轻肝组织脂肪样变性。

由于FXR在体内分布广泛，参与众多基因表达的调节，本实验观察到石斛合剂能增加糖尿病模型动物的肝FXR蛋白表达，为以FXR为靶点，深入探讨中药防治糖尿病及其并发症提供新思路与可能性。