李 敏 朱玥洁 胡金伟 顾 挺 于明凯 陈志强 丁剑冰 张峰波

1.新疆医科大学第一附属医院医学检验中心，新疆乌鲁木齐 830054；2.新疆医科大学第一附属医院生殖助孕中心，新疆乌鲁木齐 830054；3.新疆医科大学基础医学院免疫学教研室，新疆乌鲁木齐 830011

布鲁氏菌是一种革兰氏阴性球杆状菌，属于细胞内寄生菌，可以引起人类布鲁氏菌病的发生。近年突发的公共卫生事件层出不穷，控制好布鲁氏菌的发病率面临着巨大挑战[1]。因此，积极研发布鲁氏菌疫苗，是减少布鲁氏菌病发病最为有用的方式。与传统疫苗比较，表位疫苗作为新兴的疫苗研发技术，可以提高疫苗的安全性、有效性[2]。前期的研究证实，布鲁氏菌的外膜蛋白（outer membrane proteins，Omps），如Omp25、Omp31、Omp2b、Omp10 和Omp19 具有良好的免疫原性和免疫反应性，是研究布鲁氏菌疫苗的良好选择[3-7]。Omp2a 和Omp2b 的编码基因在布鲁氏菌基因组中关系密切。而Omp2a 的L5 环比Omp2b 的L5 环更短且带负电荷的残基更少[8]，且具有良好的免疫原性，可以在宿主中激活体液免疫和细胞免疫[9]。布鲁氏菌还编码另一种含Toll 样受体结构域的BtpB，它可以抑制Toll 信号传导[10]。将两者的优势表位结合可以使疫苗的效价更高。

1 材料与方法

1.1 材料来源

在UniProt 数据库中，查找羊种布鲁氏菌属Omp25和BtpB 的氨基酸序列。

1.2 研究方法

如图1 所示，在对其进行了一系列分析之后，选择优势细胞表位进行多表位疫苗的构建，最后进行评估。

图1 多表位疫苗设计流程图

1.2.1 理化性质的预测 应用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）在线分析理化性质。

1.2.2 抗原性的预测 应用VaxiJenv2.0[11]来分析抗原性，阈值为0.4。

1.2.3 信号肽的预测 应用SignalP5.0 预测信号肽的位置。

1.2.4 二级结构的预测 应用SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）在线分析软件分析二级结构。

1.2.5 三级结构的预测及模型质量评估 应用I-TASSER[12-13]（https：//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/）及Discover Studio（2019）构建及展示三级结构。应用ProSA-web[14-15][ProSA-web-Protein Structure Analysis（sbg.ac.at）]和SWISS-MODEL[Structure Assessment（expasy.org）]的结构评估服务来评估模型的质量。

1.2.6 T 细胞表位的预测 通过应用SYFPEITHI（http：//www.syfpeithi.de/bin/mhcserver.dll/epitopeprediction.htm）和IEDB（http：//tools.immuneepitope.org/main/）来预测T 细胞表位，软件中相同的序列且评分高的表位为优势表位。

1.2.7 B 细胞表位的预测 应用IEDB，BepiPred 1.0[16]和BCPREDS（http：//ailab-projects1.ist.psu.edu：8080/bcpred/predict.html）来预测B 细胞表位。在应用上述软件分析时，排除低于5 个氨基酸的序列；根据IEDB预测的β-折叠、表面可及性、灵活性和亲水性的结果，去除了阈值以下的表位，最后得到了评分高的表位。其中，软件中共同含有的表位为优势B 细胞表位。

1.2.8 多表位疫苗的构建 选取AAY、GPGPG 和KK连接优势CTL、Th 和B 细胞表位。使用EAAAK 连接佐剂并插入到蛋白N 端以增强疫苗的免疫原性[17]，在C 端添加组氨酸标记，最终得到完整的疫苗序列。

1.2.9 致敏性的预测 运用AllergenFP1.0 来分析疫苗的致敏性。

1.2.10 免疫模拟 应用C-ImmSim（https：//kraken.iac.rm.cnr.it/C-IMMSIM/）进行免疫模拟[18]，模拟疫苗3 次注射时间。在哺乳动物中，3 针注射时间间隔为4 周，注射时间步长分别是1，84 和168[19]。

2 结果

2.1 氨基酸序列

在数据库中，获得了Omp2a（登记号：Q7CNU3）和BtpB（登记号：A0A5P3L3F0）的氨基酸序列。

2.2 氨基酸的抗原性

Omp2a 抗原性预测结果为0.54；BtpB 抗原性预测结果为0.49。两种蛋白质的预测结果可能具有抗原性，得分越高其抗原性越高。

2.3 氨基酸的基本结构和理化性质

两种蛋白质为亲水性的稳定蛋白（表1），适合作为抗原的备选。

表1 氨基酸的基本结构和理化性质

2.4 氨基酸的信号肽

分析结果可知，Omp2a 中可能具有信号肽，除去可能存在信号肽的1-30 肽段。在BtpB 中，存在信号肽的可能极低。见图2。

图2 Omp2a 的信号肽

2.5 二级结构

分析软件结果显示，Omp2a 中β-转角占8.17%，无规卷曲占40.60%；BtpB 中β-转角占7.53%，无规卷曲占31.85%。见图3。

图3 蛋白质的二级结构

2.6 三级结构

建模后Omp2a 预测所得C 值为-2.04，TM值为（0.47±0.15）；BtpB预测所得C值为-1.72，TM值为（0.51±0.15）。C 值通常在-5～2 范围内，其中C 分数越高代表模型越可靠。TM 值＞0.5 则意义较大，＜0.17 则模型的随机性较大。见图4。

图4 蛋白质的三级结构

2.7 T 细胞表位分析

选取SYFPEITHI 分值和IEDB 百分等级排名前10 位的表位，取其共有序列后从Omp2a 中获得了3 个Th 优势表位和5 个CTL 优势表位，从BtpB 中获得了1 个Th 优势表位和5 个CTL 优势表位。其中，分值越高，百分等级越低的表位为正确表位的可能性越大。

2.8 B 细胞表位分析

通过应用IEDB，在Omp2a 中获得了4 个B 细胞优势表位。为保证结果的准确性，又选取了BepiPred 排名高及BCPred 得分>0.75 的表位，最终通过选取3 个软件的共有序列后得到2 个优势表位。其中，β-转角、表面可及性、可变形性、亲水性在阈值以上，得分越高的表位为正确表位的可能性越大。同理，在BtpB 中使用这3 个软件进行预测，最终得到了1 个优势表位。

2.9 多表位疫苗的构建及其理化性质

构建的疫苗（图5），由316 个氨基酸组成，为亲水性的稳定蛋白，其抗原性为0.66，具有良好的抗原性，且为非过敏原。

图5 多表位疫苗构建体示意图

2.10 表位疫苗的三级结构及模型质量评估

三级结构完成建模后所得C 值为-4.36，TM 值为（0.26±0.08）；模型的可信度较大。然后，将上述疫苗进一步展示，模型中蓝色越深代表亲水可能性大，棕色越深代表疏水可能性大；颜色越粉代表为供体可能性大，颜色越绿代表为受体可能性大。可见，设计的疫苗为亲水性且为配体的可能性大。Z 分数表示整个模型的质量。疫苗的Z 分数为-7.06，表示在天然蛋白质的特征范围，则为正确蛋白质结构的可能性大。为保证结构的准确性，又使用拉氏图来进一步评估模型的质量。允许区即图中的深绿色区域，最大允许区即图中的浅绿色区域，不允许区即图中的空白区域。可见图中的点状结构大部分落在区间范围内。故疫苗的三级结构模型的可信度大。见图6。

图6 疫苗三级结构及模型质量评估图

2.11 免疫模拟

在线免疫模拟器用于评估实际疫苗注射入人体后所引起的免疫反应水平。整体来看，初级免疫应答主要是引起IgM 和IgG 的升高，次级免疫应答主要是引起IgG1、IgG1+IgG2 和B 细胞的升高。另外，疫苗也可以引起高应答的细胞因子反应，其中最主要的是引起γ 干扰素、白细胞介素-23、白细胞介素-10 和白细胞介素-12 水平的升高。最重要的，疫苗中的T 细胞表位具有免疫原性，这和之前的预测结果保持一致。另外，在每次注射疫苗后，都会引起巨噬细胞的增加，而自然杀伤细胞在整个免疫过程中大多保持在一定的高水平。见图7。

3 讨论

人类布鲁氏菌病的主要致病菌为羊种布鲁氏菌[20]。人类可以通过吸入含布鲁氏菌的气溶胶、饮用未巴氏灭菌的患病羊奶等方式感染布鲁氏菌。人感染布鲁氏菌后，可以表现为发热、乏力、关节痛和肌肉疼痛[21]。布鲁氏菌病如治疗不及时易导致疾病反复发作、慢性化，迁延数年甚至终生不愈，而目前尚未有预防人类布鲁氏菌病的疫苗。因此，迫切需要研制相关疫苗来解决目前布鲁氏菌病的临床难题。

蛋白质的结构与其功能密切相关，Omp2a 作为布鲁氏菌的外膜蛋白，具有良好的免疫原性。BtpB 具有Toll 样受体结构域，与调节重要免疫通路的激活等有关[22]。通过分析发现，两种蛋白质为亲水性的稳定蛋白。亲水性良好，提示蛋白质对水有较大的亲和能力；稳定性良好，说明蛋白质不容易发生变形，适合用来设计疫苗。在信号肽的预测中，发现Omp2a 可能存在信号肽，而BtpB 可能不存在信号肽。在蛋白质的二级结构中，两种蛋白质的β-转角和无规卷曲所占比例较高，容易形成抗原表位[23]。

选择布鲁氏菌病高发地区人群高表达的HLAA*1101 和HLA-DRB1*0301 等位基因进行分析细胞表位[24]。单个表位组成的疫苗抗原性低于T、B 细胞表位联合后构建的疫苗[25]。经过分析，在Omp2a 和BtpB 中获得了优势细胞表位。构建的疫苗蛋白含有316 个氨基酸，为亲水性的稳定蛋白。抗原性为0.66，提示抗原性高，且为非致敏原；其三级结构显示蛋白质结构稳定性强，容易形成抗原表位，适合作为疫苗的备选。最后将疫苗的三级结构进一步评估模型的质量，可知模型可信度高。通过免疫模拟，本研究看出疫苗可能产生一定的免疫反应。本研究后续需进一步完善相关实验。

综上所述，本研究将Omp2a 和BtpB 的优势表位重组，且重组后的疫苗抗原性好，可以作为布鲁氏菌病的候选疫苗，为今后相关疫苗的研究提供理论资料。