魏浩飞 孙海滨 王川 李新江

河北医科大学第二医院普外科，河北石家庄 050000

胃腺癌是常见的胃肠道恶性肿瘤，发病率和死亡率较高[1]。早期胃腺癌以手术治疗为主，晚期则以化疗、免疫等综合治疗为主，但患者仍会出现肿瘤复发转移，导致死亡[2-3]。深入研究胃腺癌发生机制，寻找新的诊断治疗靶点，对胃腺癌早期诊治意义重大。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）ADPGKAS1 基因位于人类11 号染色体，广泛表达于骨髓、肾脏及前列腺等组织[4]。近年来发现[5-6]，lncRNA ADPGKAS1 在多种恶性肿瘤中表达上调。微小RNA（microRNA，miR）-1301-3p 基因位于2q23.3，编码基因包含有一个外显子。研究表明[7-8]，食管癌、胰腺癌等恶性肿瘤中miR-1301-3p 表达上调，其作为一种促癌基因，通过激活糖原合酶激酶3β，促进肿瘤的恶性增殖。有研究报道[9]，lncRNA ADPGK-AS1 能够作为分子支架结合miRNA，促进肿瘤增殖和转移。目前lncRNA ADPGK-AS1、miR-1301-3p 在胃腺癌中表达及相关性的研究报道较少，本文就此进行分析，以期为临床工作提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2016 年5 月至2018 年5 月河北医科大学第二医院（以下简称“我院”）收治的142 例胃腺癌患者。男80 例，女62 例；年龄35～80 岁，平均（58.6±6.6）岁；淋巴结转移：有43 例，无99 例；肿瘤直径：＜5 cm 85 例，≥5 cm 57 例；肿瘤位置：胃底部和胃体部39 例，幽门部和胃窦部103 例；肿瘤分期：Ⅰ～Ⅱ期92 例，Ⅲ期50 例；肿瘤分化程度：高中分化92 例，低分化50 例。纳入标准：①由病理检查明确为胃腺癌，接受胃腺癌根治术治疗；②初诊患者。排除标准：①卡氏功能状态评分＜70 分；②伴重度心肺等脏器功能不全；③伴胃肠道急慢性感染性疾病；④合并其他类型恶性肿瘤；⑤接受过放化疗。本研究经我院医学伦理委员会审核通过。

1.2 研究方法

将术中获取的部分癌及癌旁组织迅速置入冻存管中，液氮中冻存，转运至实验室后置于-80℃保存。实验时取50 mg 组织加入Trizol 后，组织匀浆器研磨组织，Trizol 试剂提取组织RNA，Narodrop1000 测定RNA 纯度和纯度。逆转录为cDNA 后进行实时定量PCR 反应，总反应体系11 μl：模板0.2 μl，2×SYBR Green Premix 5 μl，正向和反向引物各1 μl，双蒸水3.8 μl。反应程序：95℃预变性5 min，1 个循环；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35 个循环。正向和反向引物序列见表1。lncRNA ADPGK-AS1 以GAPDH 为内参，miR-1301-3p 以U6 为内参，2-ΔΔCt法对lncRNA ADPGK-AS1、miR-1301-3p 表达量进行分析。以lncRNA ADPGK-AS1、miR-1301-3p 相对表达量的平均值进行分组[10]，分为高表达组和低表达组。高lncRNA ADPGK-AS1 组69 例，低lncRNA ADPGKAS1 组73 例；高miR-1301-3p 组70 例，低miR-1301-3p 组72 例。

1.3 随访

患者出院后每3 个月电话随访1 次，随访截至2021 年5 月，随访时间结束或出现患者死亡为随访终点，统计术后3 年生存情况。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件分析数据。计量资料符合正态分布时用均数±标准差（）表示，比较采用t 检验。采用Pearson 相关性分析相关性。采用LncBase Predicted V.2 数据库分析预测lncRNA ADPGK-AS1与miR-1301-3p 的作用。采用Kaplan-Meier 绘制生存曲线，比较采用log-rank 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 癌和癌旁组织中lncRNA ADPGK-AS1、miR-1301-3p 表达

胃腺癌组织中lncRNA ADPGK-AS1、miR-1301-3p 表达均高于癌旁组织（P ＜0.05）。见图1。

图1 癌和癌旁组织中lncRNA ADPGK-AS1、miR-1301-3p 表达比较（n=142）

2.2 lncRNA ADPGK-AS1 与miR-1301-3p 表达的相关性及相互作用预测

lncRNA ADPGK-AS1 与miR-1301-3p 表达呈正相关（r=0.601，P ＜0.001），见图2。生物信息预测结果显示，lncRNA ADPGK-AS1 在2422～2443 碱基处有与miR-1301-3p 结合的核苷酸位点，见图3。

图2 lncRNA ADPGK-AS1 与miR-1301-3p 表达的相关性（n=142）

图3 lncRNA ADPGK-AS1 与miR-1301-3p 的相互作用位点

2.3 lncRNA ADPGK-AS1、miR-1301-3p表达对胃腺癌患者生存预后的影响

随访3～36 个月，中位随访时间为27.1 个月，中位生存时间为26.3 个月，失访5 例，死亡60 例。lncRNA ADPGK-AS1 高表达组患者中位生存期为23.3 个月（95%CI：15.2～26.1），低于lncRNA ADPGK-AS1 低表达组的31.6 个月（95%CI：22.9～34.9）（χ2=11.221，P ＜0.001）。miR-1301-3p 高表达组患者中位生存期为24.2 个月（95%CI：17.6～28.5），低于miR-1301-3p 低表达组的30.5 个月（95%CI：21.6～34.5）（log-rank χ2=10.268，P ＜0.001）。见图4。

图4 不同lncRNA ADPGK-AS1、miR-1301-3p 表达水平患者的生存曲线

3 讨论

胃腺癌是多因素共同作用的结果，涉及遗传学和表观遗传等基因的表达变化[11]。胃肠道肿瘤的标志物包括碳水化合物抗原（carbohydrate antigen，CA）19-9、CA72-4、癌胚抗原等，然而单一的胃腺癌肿瘤标志物灵敏度和特异度较低，临床应用价值有限[12]。近年来随着肿瘤免疫等基础研究的进展，研发出新的治疗药物如免疫检查点抑制剂等，一定程度上改善了患者的生存预后[13]。因此，寻找新的影响胃腺癌进展的分子靶点，有较高的临床价值。

lncRNA 是参与正常细胞过程的重要调节因子，包括染色质重塑过程、基因转录后修饰和细胞内信号转导等[14-15]。lncRNA ADPGK-AS1 编码基因位于15q24.1，含有3 个外显子。研究发现，lncRNA ADPGKAS1 在肿瘤中表达升高，并作为一种促癌基因促进肿瘤的进展[6，9]。本研究中，癌组织lncRNA ADPGK-AS1的表达水平显著上调，目前机制尚不清楚。有研究表明，lncRNA ADPGK-AS1 的表达上调与基因拷贝数增加有关，lncRNA ADPGK-AS1 基因拷贝数增加促进恶性肿瘤的恶性进展，在肿瘤发生中起驱动作用[16]。另研究发现，lncRNA ADPGK-AS1 作为miR-3196 的分子海绵，诱导肿瘤细胞中癌基因同源盒基因1 的表达，进而促进肿瘤细胞由上皮样表型向间质表型转化，导致肿瘤细胞侵袭和转移能力增强[17]。本研究结果显示，lncRNA ADPGK-AS1 高表达的患者预后较差，因此检测lncRNA ADPGK-AS1 可能是新的胃腺癌潜在预后标志物。

miR-1301-3p 是一种短片段的lncRNA，成熟的miR-1301-3p 能整合到RNA 诱导的沉默复合物中，它通过不完全碱基配对识别靶基因mRNA，导致靶基因mRNA 的翻译抑制或不稳定[18]。近年来发现，miR-1301-3p 在结直肠癌及肝癌中异常表达，其作为一种促癌因子，参与肿瘤进展，导致患者的不良预后[19-20]。本研究发现，胃腺癌癌组织miR-1301-3p 表达上调，目前机制尚不明确。有研究发现，zeste2 多梳抑制复合物2 亚基增强子能够诱导乳腺癌细胞miR-1301-3p 的表达，进而促进肿瘤细胞的生存[21]。有学者发现，miR-1301-3p 的过表达促进了肿瘤细胞的贴壁依赖性生长，抑制p27 表达并促进细胞周期蛋白D1 表达，通过促进细胞周期G1/S 转变，促进细胞增殖[22]。本研究结果显示，miR-1301-3p 高表达患者预后更差，提示miR-1301-3p 可以反映患者的预后情况。

通过相关性分析发现，胃腺癌中lncRNA ADPGKAS1 与miR-1301-3p 表达呈正相关，在线生物信息学软件发现lncRNA ADPGK-AS1 序列2422-2443 碱基处含有与miR-1301-3p 相互结合的位点。研究表明，lncRNA ADPGK-AS1 能够作为一种分子海绵，结合下游多种miRNA，促进肿瘤增殖和转移[5，17]。体外细胞实验证实，lncRNA ADPGK-AS1 能够调控胃腺癌细胞中miR-1301-3p 的表达，进而促进胃腺癌细胞的增殖，抑制凋亡[23-24]。但两者在胃腺癌中的相互调控关系有待深入研究。

综上所述，胃腺癌中lncRNA ADPGK-AS1、miR-1301-3p 表达上调，两者存在相互结合的位点，是胃癌预后预测的潜在分子标志物。