郑洋 张慧 李晓惠 张明明 林瑶 石琳

首都儿科研究所附属儿童医院心血管内科，北京 100020

川崎病（Kawasaki disease，KD）又称皮肤黏膜淋巴结综合征，是一种血管炎症综合征，可累及全身多器官，以心血管后遗症最为严重，包括冠状动脉扩张、冠状动脉瘤、血栓形成及心肌梗死[1-3]。巨大冠脉瘤（giant coronary artery aneurysm，GCAA）是冠状动脉瘤最严重的类型，可持续存在并进展，是导致KD 合并血栓形成及心肌梗死的最主要原因，严重危害儿童身心健康[4]。如何早期预警这些高危患儿并积极干预是目前亟待解决的临床与科学问题。微RNA（microRNA，miRNA）是一类长度为18～25 个碱基的内源性非编码RNA，通过降解靶基因mRNA 或抑制mRNA 的翻译发挥生物学功能[5-6]。近年来有关miRNA 的研究表明，部分异常表达的miRNA 与癌症及心血管疾病密切相关[7-10]。有研究提示miRNA 可能成为KD 早期诊断标志物[11]，但有关miRNA 与GCAA 形成的相关机制鲜有报道。本研究探索miRNA-205-3p 在KD 合并GCAA 发病中的作用机制，并在动物模型上进行验证，为GCAA 的早期诊断和发生机制探索提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 研究对象 选取2018 年11 月至2021 年2 月于首都儿科研究所附属儿童医院（以下简称“我院”）心内科住院治疗的KD 患儿36 例，其中KD 组30 例，KD 合并GCAA 组6 例。按频数匹配同期年龄、性别的于我院体检的健康对照儿童和明确病原的发热对照患儿各20 例（KD 组及KD 合并GCAA 组∶健康对照组∶发热对照组=1.8∶1∶1）。本研究通过我院伦理委员会审批（SHERLL2018020）。

纳入标准：①川崎病患儿诊断标准参照2017 年美国心脏协会指南[3]；②发热患儿为经呼吸道病毒7项检测明确病原体的急性呼吸道感染患儿。排除标准：川崎病患儿：①合并其他部位血管瘤；②临床资料不完整；③家长拒绝参与研究。发热患儿：①不明原因发热患儿；②病毒感染累及下呼吸道患儿。

1.1.2 实验动物 3～4 周龄C57BL/6 SPF 级健康雄性小鼠共12 只，体重（16.43±0.91）g，采购自北京维通利华实验动物有限公司[许可证号SCXK（京）2016-0006；合格证号No.110011211104810921]，于屏障环境下饲养，人工控温22～26℃，室内照明14 h∶10 h 明暗交替。符合我院动物伦理要求。

1.2 实验方法

1.2.1 血液样本采集 KD 组及KD 合并GCAA 组标本采样于患儿入院确诊后，开始静脉用人免疫球蛋白治疗前，于清晨空腹留取静脉血2 ml，置于EDTA 抗凝管，于4℃，1760 g 离心5 min，将上层血浆和下层血细胞分开收集于1.5 ml 无菌离心管中，于-80℃冰箱保存。健康对照组及发热对照组于清晨空腹留取静脉血2 ml，样本处理同前。

1.2.2 基因芯片分析及荧光定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）验证 通过基因芯片分析KD 组、KD 合并GCAA 组、健康对照组、发热对照组（每组3 例）差异表达的miRNA。按照TRIzol（美国，Thermo，15596026）试剂说明提取总RNA；采用逆转录试剂盒（中国，生工生物工程，B532451）进行miRNA 的逆转录和扩增；采用qPCR 试剂盒（中国，生工生物工程，B532461）进行qPCR。逆转录及扩增体系：2×miRNA RT Solution Mix 10 μl、miRNA RT Enzyme Mix 2 μl、RNA 2 μl（总量约为2 μg）、RNase-Free Water 6 μl 制成反应体系20 μl；反应条件：37℃，60 min，85℃，5 min，4℃；qPCR 反应体系：2×miRNA qPCR Master Mix 10 μl、miRNA 正向引物0.5 μl、miRNA 反向引物0.5 μl、cDNA 2 μl、ROX Referrence Dye（H）1 μl、RNase-Free Water 6 μl 制成反应体系20 μl；qPCR 反应条件：95℃，30 s 预变性；95℃，5 s 变性；60℃，30 s 退火/延伸；循环40 次，记录反应CT 值。使用2-△△Ct法计算miRNA 的相对表达量。人miRNA-205-3p 引物序列：正向引物为5’-CGCGGATTTCAGTGGAGTGAAGTTC-3’；反向引物为3’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-5’；内参U6序列：正向引物为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；反向引物为3’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5’。

1.2.3 生物信息学分析 通过DIANA TOOLS-mir-Pathv.3、KEGG 分析查询所有差异表达miRNA 的相关信号通路，分析与KD 组及KD 合并GCAA 组发生的相关通路。

1.2.4 小鼠模型构建及心脏组织mRNA 水平测定 选取3～4 周龄C57BL/6 SPF 级雄性小鼠12 只，采用随机数字表法分为KD 合并冠状动脉病变（coronary artery lesion，CAL）组及对照组，每组6 只。KD 合并CAL 组小鼠腹腔注射干酪乳杆菌细胞壁成分（中国，CICC，6104）0.5 ml（浓度1 mg/ml），对照组注射磷酸盐缓冲液0.5 ml；人工控温22～26℃，室内照明14 h∶10 h 明暗交替，自由饮水进食。于第2 周麻醉后在超声下观察小鼠的冠脉扩张情况；麻醉后处死小鼠，摘取心脏组织，制作病理切片并观察冠脉情况，若周围有炎症细胞浸润，证明造模成功[12]。其余心脏组织液氮速冻后置于-80℃保存。

按照RNeasy Mini Kit 试剂盒（德国，Qiagen，74104）说明提取鼠心脏组织mRNA；采用逆转录试剂盒（加拿大，Abm，G492）进行mRNA 的逆转录和扩增；采用qPCR 试剂盒（加拿大，Abm，M-LR）进行qPCR。逆转录及扩增体系：AccuRT Reaction Mix (4×) 2 μl、RNA 2 μl（总量约为2 μg）、RNase-Free Water 4 μl（定容至8 μl），于室温静置5 min，再加入AccuRT Reaction Stopper(5×) 2 μl，摇匀，加入5×All-In-One Rt Master Mix 4 μl、RNase-Free Water 6 μl 制成反应体系20 μl；反应条件：25℃，10 min，42℃，15 min，85℃，5 min，qPCR 反应体系：EvaGreen 2×qPCR Master Mix 10 μl、mRNA 正向引物0.6 μl、mRNA 反向引物0.6 μl、cDNA 1 μl、RNase-Free Water 7.8 μl 制成反应体系20 μl；反应条件及表达量测量方法同“1.2.2”。mRNA-转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）引物序列：正向引物为5’-TTGCTTCAGCTCCA-CAGAGA-3’；反向引物为3’-TGGTTGTAGAGGGC-AAG GAC-5’；mRNA-SMAD5引物序列：正向引物为5’-GATTGTTGGGCTGGAAACAAG-3’；反向引物为3’ -CTCCATAGCACCCTTCTTCTTC-5’；内参GAPDH 序列：正向引物为5’-TATGTCGTGGAGTCTACTGGT-3’；反向引物为3’-GAGTTGTCATATTTCTCGTGG-5’。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0 对所得数据进行统计学分析，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t 检验；非正态分布的计量资料采用中位数（四分位数）[M（P25，P75）]表示，比较采用Kruskal-Wallis 非参数检验。计数资料采用例数表示，组间比较采用χ2检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人口学信息

本研究中共收集KD 患儿36 例，其中KD 组30 例，平均年龄（2.33±1.31）岁，男∶女=2∶1；KD 合并GCAA组6 例，平均年龄（1.28±0.54）岁，男∶女=2∶1；按频数匹配健康对照组20 名，平均年龄（2.71±1.71）岁，男∶女=3∶1；发热对照组20 例，平均年龄（2.96±1.42）岁，男∶女=2.3∶1（KD 组及KD 合并GCAA 组∶健康对照组∶发热对照组=1.8∶1∶1）。各组年龄、性别比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），具有可比性。

2.2 基因芯片分析

通过基因芯片分析KD 组、KD 合并GCAA 组、健康对照组及发热对照组，各组间差异表达＞10 倍且P ＜0.05 的miRNA 共12 个。基因芯片结果见表1。

2.3 各组miRNA-205-3p 表达量比较

KD 组miRNA-205-3p 表达量高于健康对照组及发热对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；KD 合并GCAA 组miRNA-205-3p 表达量高于健康对照组、发热对照组及KD 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表2。

表2 各组miRNA-205-3p 表达量比较[M（P25，P75）]

2.4 生物信息学分析结果

miRNA-205-3p 在MAPK 信号通路及TGF-β/SMAD5 信号通路中作用显著。见表3、图1～2。

表3 miRNA-205-3p 部分相关通路及涉及靶基因

2.5 小鼠模型心脏组织病理切片

镜下可见KD 合并CAL 组小鼠心脏冠状动脉周围炎症细胞增多；对照组小鼠无明显炎症细胞浸润，证明造模成功。见图3。

2.6 TGF-β/SMAD5 信号通路在冠脉损伤小鼠心脏组织中的表达

KD 合并CAL 组小鼠心脏组织TGF-β1 mRNA 表达量（3.93±2.42）高于对照组（1.42±1.23），差异有统计学意义（t=2.272，P ＜0.05）；KD 合并CAL 组小鼠心脏组织SMAD5 mRNA 表达量（2.98±1.53）高于对照组（1.05±0.34），差异有统计学意义（t=3.040，P ＜0.05）。

3 讨论

近年来，KD 的发病率有增高趋势，成为儿童获得性心脏疾病的主要病因。KD 合并GCAA 可能会引起血栓形成、瘤体破裂甚至猝死等严重结局[4]，目前发生机制仍不清楚。本研究发现miRNA-205-3p 在KD 及KD 合并GCAA 患儿中表达水平明显升高；经生物信息分析和动物模型验证，提示miRNA-205-3p 可能通过TGF-β/SMAD 通路参与KD 及GCAA 形成。

miRNA-205-3p 可在多种RNA 信号轴中起作用[13]。研究发现，miRNA-205-3p 在胶质瘤及胃癌中可通过TGF-β 调节上皮-间充质细胞转换[14-15]，提示miRNA-205-3p 通过TGF-β 信号通路在多种疾病中发挥病理作用。TGF-β 参与心血管系统多种生理和病理变化的调节，如诱导心肌细胞肥大、纤维化和钙化[16-17]。SMAD5 是一种受体激活型SMADs，可直接被TGF-β磷酸化激活并参与其信号通路的调控[18-19]，其缺失可能导致细胞稳态发生变化。Cho 等[20]针对SMAD5 的基因多态性进行分析，发现与KD 相关的SNP 分型。

TGF-β/SMAD5 信号通路可引发心脏结构的病理变化：通路的激活可促进细胞外基质的生成和细胞环境的改变，引发病理变化[21-22]。当TGF-β/SMAD5 表达升高时，弹力板和胶原纤维弹性被破坏，血管壁收缩功能及强度下降，冠脉结构和功能的完整性受损，在高速冲击的血流下，出现血管壁扩张，最终导致KD 的病理改变；同时，激活的TGF-β/SMAD 通路可以导致内皮功能障碍[23]，TGF-β 可通过SMAD 通路，包括SMAD1/5 信号促进上皮-间充质细胞转换等一系列病理变化，改变细胞表型和功能，介导血管瘤的形成[24-27]。本研究通过构建小鼠模型，验证了TGF-β/SMAD5 通路在KD 中的促进作用。

本研究的不足在于：KD 合并GCAA 的发病率较低，使病例数较少，如果有条件，可在扩大GCAA 患儿样本量的情况下再次验证；探索出的作用机制有待经过后续细胞实验、动物实验等进一步验证。

综上所述，本研究发现在KD 及KD 合并GCAA 患儿中，miRNA-205-3p 的表达水平升高，提示miRNA-205-3p 可能作为KD 诊断及早期评估病情严重程度的生物标志物，其作用机制可能通过TGF-β/SMAD5信号通路。该研究为KD 合并GCAA 的发病机制研究提供了新靶点。