常瑞红，刁亚琴，郭亚飞，谢 旭，洪 胜，姜 勇，徐 丽

（江苏洋河酒厂股份有限公司，江苏宿迁 223800）

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate，EC)，又称尿烷，易溶于水及醇类溶剂中，是食品发酵及贮藏过程中产生的一种可导致皮肤癌、肺癌、淋巴癌等疾病的内源性2A类致癌污染物，广泛存在于酒类、面包、乳酪、酱油等发酵食品中。白酒作为中国特有的发酵食品，深受大众喜爱，EC 在各种香型白酒中普遍存在且含量相对较大，对消费者健康有潜在危害，因此白酒中EC 的安全风险成为行业关注的热点问题。目前，国内外针对白酒EC相关研究主要集中在酒中EC分析和相关控制技术方面，对白酒发酵相关的固态酒醅检测方法研究相对较少，为深入探究EC形成机理及白酒中EC有效控制技术，研究酒醅中EC有效检测方法具有重大意义。

目前，HPLC 法、GC 法、GC-MS 法等是常用的EC 检测方法。由于酒醅基质复杂，前处理技术是影响检测方法的关键因素，国内研究学者常采用溶剂（乙醚或水）萃取后离心过硅藻土小柱净化，再经有机溶剂清洗、洗脱、氮吹浓缩等步骤。整个前处理过程步骤繁琐，操作不便，污染环境，不适宜生产企业大批量检测应用。

本研究以乙醇溶液为萃取剂，经活性炭净化后直接进样的方式建立酒醅中EC 检测方法，重点考察萃取溶剂乙醇浓度（V/V）、方法线性等，旨在建立一种准确快速、操作简便且适宜企业生产的酒醅检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

酒醅试样：江苏洋河酒厂股份有限公司出池酒醅。

试剂：氨基甲酸乙酯标准品（纯度大于99.0 %）、氘代氨基甲酸乙酯标准品（纯度大于98.0 %），上海安谱科技有限公司；活性炭，重庆霏洋环保科技股份有限公司；乙醇（色谱级），德国默克公司；一级水，实验室制备。

仪器设备：7890A-5975C 气相色谱仪-质谱仪（带EI 源），美国安捷伦；电子天平（万分之一），梅特勒-托利多仪器有限公司；超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液配制

内标储备液（1.00 mg/mL）：准确称取0.01 g（精确到0.0001 g）氘代氨基甲酸乙酯标准品，无水乙醇溶解、定容至10 mL。

内标使用液（20.00 μg/mL）：准确吸取氘代氨基甲酸乙酯储备液1.0 mL，无水乙醇定容至50 mL。

氨基甲酸乙酯储备液（1.00 mg/mL）：准确称取0.01 g（精确到0.0001 g）氨基甲酸乙酯标准品，无水乙醇溶解、定容至10 mL。

标准曲线工作溶液：用无水乙醇分别配制10.0 μg/mL 和0.50 μg/mL 氨基甲酸乙酯中间液，分别取0.50 μg/mL 氨基甲酸乙酯中间液100.0 μL、250.0 μL、500.0 μL、1.0 mL、2.0 mL 和10.0 μg/mL氨基甲酸乙酯标准中间液200.0 μL、400.0 μL 于5 mL 容量瓶中，无水乙醇定容至刻度，再各加20.0 μg/mL 内标使用液50 μL，得到10.0 μg/L、25.0 μg/L、50.0 μg/L、100μg/L、200 μg/L、400 μg/L、800 μg/L的标准曲线工作溶液。

1.2.2 仪器条件

气相色谱条件：DB-INNOWAX 毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。进样口温度：230 ℃。升温程序：初始柱温70 ℃，保持l min，以6 ℃/min升温至180 ℃，保持1 min，再以30 ℃/min 升温至240 ℃，保持2 min。载气：氦气（纯度＞99.999%），流速：l mL/min。

进样方式：不分流进样。进样量：1µL。

质谱条件：电离方式：电子轰击电离源(EI)。电离能量：70 eV。传输线温度：280 ℃。

离子源温度：230 ℃。四级杆温度：150 ℃。溶剂延迟：8 min。

1.2.3 样品处理

准确称取出池酒醅样品3.000 g(精确至0.001 g)于50 mL 离心管中，加入15 mL 的60%（V/V）乙醇溶液，超声波振荡仪浸提60 min，将浸提液离心，在4 ℃下，以10000 r/min 离心15 min，取上清液10 mL至25 mL 离心管中，加入0.3 g (3 % W/V)活性炭，超声波振荡仪超声30 min，按上述离心条件离心，取5 mL 上清液至比色管中，加入50 μL 内标使用液，混匀过0.22 μm滤膜，GC-MS分析检测。

1.2.4 结果计算

不同浓度混合标准工作溶液分别重复进样3次，利用色谱工作站对3 次进样EC/D5-EC 浓度比和响应比建立标准曲线，测定结果保留两位小数。

式中：X——样品中EC含量，μg/kg；

c——测定液中EC含量，μg/L；

3——样品萃取液稀释倍数；

m——样品质量，g；

1000——换算系数。

2 结果与分析

2.1 乙醇浓度的优化

EC 易溶于乙醇、水、甲醇、乙醚等极性溶剂，在萃取食品中EC 时，常用溶剂为乙醚、水等，乙醚毒性大，沸点低且易燃易爆，实验步骤繁琐；水是EC的良好溶剂，直接进GC-MS 分析EC，含水量大的试剂会严重影响柱效。有研究表明随着乙醇浓度的升高EC 的响应值升高，由于EC 响应值足够大，乙醇含量的影响亦可以忽略。王莉等在专利中采用了40%乙醇萃取-衍生-液相色谱分析以测定酒醅中氨基甲酸乙酯。故采用乙醇溶液作为萃取试剂。

由图1 可知，不同浓度乙醇（V/V）对酒醅中EC萃取效果的影响显著，纯水萃取条件下，氨基甲酸乙酯检出值较低，0 %（V/V）～60 %（V/V）乙醇浓度呈上升趋势，60 %～100 %变化不显著，虽然氨基甲酸乙酯在水中溶解度较好，但是采用直接进样方式时，在GC-MS 中响应较低，乙醇在60 %处有较好的响应值，故采用60 %（V/V）乙醇作为萃取浓度。

图1 不同乙醇浓度对EC萃取效果的影响

2.2 活性炭净化用量的优化

活性炭具有发达的孔结构，比表面积较大，可吸附酒中的高级脂肪酸酯、杂质及降低杂味。酒醅经过乙醇溶液萃取后，颜色较深，活性炭可利用多孔固体表面吸附色素、杂质等，起到净化的作用，减少对GC-MS 进样口衬管污染，保证检测结果稳定性。

由表1 可知，添加活性炭和未添加，检出的EC值无显著差异，不同添加量对EC 的检出结果影响不大，表明活性炭对EC 没有显著吸附作用；酒醅未经活性炭处理或添加量少，都会因萃取液杂质多，净化不充分，导致经常更换衬管使检测成本增加，同时导致检测重复性差结果不准，添加过量的活性炭，离心后取样时活性炭粉末荡起，上清液移取不便。综上，添加3.0%(W/V)的活性炭作为净化最适用量。

表1 不同活性炭用量对EC检测的影响

2.3 方法线性、检出限及定量限

在10～800 μg/L EC 线性范围内分析，得到以EC浓度为X坐标，以EC和D5-EC峰面积比为Y坐标拟合标准曲线，见图2，回归方程为Y=0.8023X+0.09613，相关系数为R=1，表明标准曲线的线性良好。

图2 EC的标准曲线

以响应值的标准偏差法确定EC 的检出限和定量限，分别用测定结果3δ/S 和10δ/S 计算检出限和定量限，其中δ为标准偏差，S 为斜率。向空白样品中加标样，配置低浓度的10 μg/L 加标样品进样测试11 次，计算标准偏差，得到该分析方法的检出限为2.8 μg/kg，定量限为9.2 μg/kg。

2.4 方法的精密度和回收率

随机取两种不同酒醅试样，对处理样用10.0 μg/mL EC 标样进行3 水平添加，加标水平为20 μg/L、100 μg/L、400 μg/L，每个添加样品重复测定6 次，通过定量结果计算该方法的加标回收率和RSD，结果见表2。

由表2 可知，EC 的RSD 在1.74 %～6.17 %之间，说明方法的重现性和精密度良好；加标回收率范围在88.53 %～117.25 %之间，说明检测结果准确度良好，方法准确可靠。

表2 酒醅试样的相对标准偏差和回收率

2.5 实际样品的测定

选取不同车间小组酒醅试样采用本实验方法进行检测分析，每个试样重复检测6 次，结果见表3，在检酒醅EC 检测范围为46.26～87.96 μg/kg，测定结果的RSD在1.40%～5.44%之间。

表3 不同车间小组酒醅中EC含量（n=6）

3 结论

本研究建立了乙醇溶剂萃取结合GC-MS 直接进样检测酒醅中EC 的测定方法。结果表明，60%（v/v）乙醇溶液萃取，3.0%(W/V)活性炭净化前处理效果良好，标准曲线相关系数为1，检出限为2.8 μg/kg，定量限为9.2 μg/kg，加标回收率在88.53%～117.25%之间，说明方法准确可靠。该方法具有样品前处理简便、绿色、快速等优点，适用于大批量酒醅EC 的检测，能够满足白酒生产企业对酒醅EC风险监控的需求。