张志伟，聂士昊，汪俊卿，王瑞明，张子洋，申作树，王龙祥，李丕武

（1.齐鲁工业大学生物基材料与绿色造纸国家重点实验室，山东济南 250399；2.山东福瑞王酒业有限公司，山东临沂 276621）

白酒是世界六大蒸馏酒之一，有12 种香型。“四高两长”的发酵特点赋予了酱香型白酒独特的酱香味，其“酱香突出、醇厚绵长”等特点深受广大消费者的喜爱。白酒酿造本质上是各类微生物作用于粮谷后进行的代谢反应，南北方环境差异对酒醅中的微生物影响很大，进而影响白酒风味。在对南方酱香酒酒醅微生物研究过程中发现，芽孢杆菌、丝状真菌、酯化酵母这三类微生物在发酵过程中多次被检测到，猜想这些微生物对酱香酒风味有重要影响。

白酒酿造过程中微生物种类、数量是在不断变化的，现代科学技术的进步提供了先进检测方法，例如16S rRNA 和ITS rDNA 检测提供了细菌和真菌的同源性分析，运用PCR-DGGE 方法可对酒曲细菌多样性进行分析等。高通量测序目前运用在很多方面，这项技术可以快速测序几十万到上百万DNA，并且可以检测含量极低的DNA，目前高通量测序已经在发酵食品的真菌检测，海水微生物检测，土壤中微生物检测和医学上进行应用。采用高通量测序技术对南方酱香型白酒微生物进行研究，发现在第四轮次酒醅中主要优势真菌有嗜热子囊菌属（）、嗜热真菌属（）；堆积发酵过程中乳酸杆菌属、埃希氏菌属（）和芽孢杆菌属（）为优势细菌；窖池发酵阶段乳酸杆菌属占绝对主导地位，并且丰度随着发酵的进行不断上升。

运用气相色谱闻香法（GC-O）、气相色谱质谱联用（GC-MS）等现代方法对酱香白酒风味物质进行检测，发现己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、2,3,5,6-四甲基吡嗪的含量突出。四甲基吡嗪不但能赋予酱香酒独特风味，还是中药材川芎根茎的主要活性成分，具有治疗心血管疾病，保护肝脏等作用；乙酸乙酯对甲醛具有抑制作用，可以加快身体里不良物质的代谢；己酸乙酯有维护心肺功能的作用；4-甲基愈创木酚等酚类物质具有预防疾病、抗衰老等作用。这些风味物质的提高不仅有助于北方酱香白酒风味的改善，还对消费者有促进健康的积极作用。

通过和北方酱香酒公司进行合作，加入芽孢杆菌、丝状真菌、酯化酵母3 种微生物，结合高通量测序和气相-质谱（GC-MS）结果进一步了解这三类菌对酱酒的风味的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

样品：酒醅，山东福瑞王酒业有限公司的第五轮次发酵结束时，取上层、中层、下层及三层酒醅混合的4个酒醅样品；酒样，对应酒醅蒸馏的酒样。

取样方法：根据五点等距取样方法，在上、中、下层的中心点取样，保持相同的距离。

微生物：芽孢杆菌、丝状真菌、酯化酵母，实验室保存菌种。

LB 培养基：5 %酵母浸粉，10 %蛋白胨，10 %氯化钠，加去离子水后121 ℃灭菌20 min。

仪器设备：气相色谱质谱联用仪（GC-MS），型号GCMS-QP2020，日本岛津公司；Hermle 500 mL离心机。

1.2 试验方法

1.2.1 强化酒醅制作方法

（1）上述3 种微生物用液体培养基培养48 h，随后离心沉淀。

（2）制作种子强化大曲：在制作普通大曲的培养过程中，向大曲中添加质量10 %的微生物沉淀（50%芽孢杆菌、20%丝状真菌、30%酯化酵母）。

（3）强化酒醅制作：向酒醅中加入酒醅质量0.7%的大曲（10%强化大曲、90%普通大曲）。

1.2.2 酒醅的取样方法

在第五轮次发酵结束后，立即对对照组上层（SC-1）、对照组中层（ZC-1）、对照组下层（XC-1）以及实验组上层（SC-2）、实验组中层（ZC-2）、实验组下层（XC-2）的酒醅进行五点取样，取500 g 酒醅放入无菌的离心管中，立即存放至-80 ℃冰箱保存备用。对每池的酒醅进行混合，对照组三层酒醅混合样（HH-1）、实验组三层酒醅混合样（HH-2）共计8 个酒醅样送高通量测序。对照组和实验组各取500 mL蒸馏酒，4 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 高通量测序测序方法

PCR 扩增细菌使用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA G-3′)和806R(5′-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3′)扩增V4 高变区；真菌使用引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGG AAGTAA-3′)和2043R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)扩增高变区。30 μL PCR 混合体系中含Tks Gflex DNA Polymerase酶0.6 μL，前引物1 μL（5 pmol/μL），后引物1 μL（5 pmol/μL），2×Gflex PCR Buffer 缓冲液15 μL，模版脱氧核糖核酸（DNA）1 μL，无菌水补足30 μL。PCR条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s；56 ℃复性30 s；72 ℃延伸20 s；共26个循环，最后72 ℃延伸5 min。

1.2.4 GC-MS测定条件

表1 气相升温程序

表2 气相参数

气相条件：样品通过InertCap 毛细管柱（膜厚0.25 μm，长度30 m，内径0.25 μm）进行分离。

质谱条件：分离后的样品用质谱仪鉴定，质谱条件EI：电离源；电子能量：0.1 KV；离子源温度：230 ℃；扫描范围：29～500 amu。

2 结果与分析

2.1 细菌多样性分析

根据16S rDNA 测序分析结果得出细菌多样性指数分析。

根据Shannon、Simpson 指数显示实验组的群落多样性要高于对照组，Coverage 指数显示8 个样品中序列没有被检测出来的可能性很低，此结果有很高的可信度。

酒醅在第五轮次发酵结束后，实验池和对照池细菌种类均为下层最多，对照组的细菌OTU 数量关系为下层=上层＞中层，实验组的细菌OTU 数量关系为下层＞中层＞上层。

图1 酒醅样品细菌门水平丰富度

图2 酒醅样品细菌属水平丰富度

对照组的优势菌门是变形菌门，数量关系为上层＞中层＞下层，实验组的优势菌门是厚壁菌门，数量关系为中层＞上层＞下层，两者优势微生物的数量都是下层最少。对照组优势细菌为变形菌门，醋酸杆菌属（），芽孢杆菌属（）；实验组优势细菌为厚壁菌门，芽孢杆菌属（）。根据Shannon 和Simpson 指数得出实验组的细菌群落多样性高于对照组，说明加入的芽孢杆菌在发酵过程中很好的存在，并发挥了作用。

表3 酒醅样品细菌多样性分析

表4 酒醅样品真菌多样性分析

2.2 真菌多样性分析

酒醅在第五轮次发酵结束后，对照组的真菌OTU 数量关系为上层=中层＞下层，实验组的细菌OTU 数量关系为下层＞中层＞上层，对照组的情况与胡峰、徐佳等研究一致，实验组加入的芽孢杆菌对酵母菌形成正向影响，对真菌数量形成影响，因此实验组的真菌种类高于对照组，芽孢杆菌促进酯化酵母的生长使得OTU 数量关系为下层＞中层＞上层。

图3 酒醅样品真菌属水平多样性分析

实验组优势真菌为子囊菌门，酵母属（），毕赤酵母属（）。对照组优势真菌为子囊菌门，酵母属（），曲霉属（）。由此可见，加入的酯化酵母和丝状真菌在发酵过程中得到保存。

强化酒醅中加入微生物对风味物质的影响，目前已经有了一些研究成果。芽孢杆菌形成复杂多样的酶系（蛋白酶、淀粉酶等），代谢物质乙偶姻在发酵过程与氨形成酱香酒特征性物质2,3,5,6-四甲基吡嗪；酯化酵母在白酒发酵过程中主要有酒化和酯化的作用，酯化酵母在醪液中生成醛、酯、醇、酸等物质，对乙酸乙酯的含量有提高作用；丝状真菌主要是利用糖化力分解蛋白质、淀粉，提供给其他微生物利用，形成酯类、醛类物质，对酸碱平衡有积极作用。

2.3 GC-MS结果分析

通过GC-MS处理对照池和实验池的蒸馏酒样品，结果见图4。

图4 风味物质含量对比图

白酒中乙醇和水占总量的98 %～99 %，但白酒的风味主要由1%～2%的风味物质产生。GCMS 结果显示，实验组共检测出59 种风味物质（酯类25 种、醇类17 种、醛类4 种、酸类6 种、酮类1种、其他6 种），对照组共检测出58 种风味物质（酯类21 种、醇类17 种、醛类5 种、酸类5 种、酮类1种、其他9 种）。由图4 可知，实验组的乳酸乙酯（12.03 g/L）、己酸乙酯（1.32 g/L）、乙酸（4.57 g/L）、乙酸乙酯（8.12 g/L）、1-丙醇（0.90 g/L）、2,3,5,6-四甲基吡嗪（0.01 g/L）、甲酸乙酯（0.15 g/L）含量要高于对照组的乳酸乙酯（9.85 g/L）、己酸乙酯（0.90 g/L）、乙酸（3.65 g/L）、乙酸乙酯（6.75 g/L）、1-丙醇（0.76 g/L）、2,3,5,6-四甲基吡嗪（0.008 g/L）、甲酸乙酯（未检测出）；糠醛的含量实验组（0.32 g/L）低于对照组（0.34 g/L）。乙酸乙酯具有抗肿瘤、保护肝脏等作用；乙酸具有杀菌,帮助消化，降血脂等功能；2,3,5,6-四甲基吡嗪有扩张血管，抑制血栓形成，调节脂质代谢，调节免疫等作用；糠醛对人体有损害肝脏和中枢神经系统等有害作用。根据气质结果可以看到有益的风味物质在增加而糠醛等有害物质在减少，说明强化酒醅酿造的白酒对人体更加有益。

3 结论

通过上述结果可以得出加入酯化酵母、丝状真菌、芽孢杆菌的加强酒醅，使酱香酒的风味物质种类更加丰富多样，可以有效提高乳酸乙酯、己酸乙酯、乙酸、2,3,5,6-四甲基吡嗪、甲酸乙酯等有益物质的含量，尤其是酱香酒独特风味物质2,3,5,6-四甲基吡嗪的含量由0.008 g/L 提高到了0.01 g/L，使北方酱香酒酱香味更加醇厚，有助于改善北方酱香型白酒风味。

本研究证明，对北方酱香酒酒醅加入上述3 种微生物后有利于提高北方酱香酒的酱香风味，有助于提高白酒的有益风味物质的含量，降低有害物质的含量。目前对酱香酒发酵微生物研究主要集中于这3 种微生物，很多有益微生物的作用有待研究，希望将来能在微生物方面对北方酱香酒风味进行改善。