聂 叶，焦 富，罗汝叶，李巧玉，牟明月

（贵州茅台酒股份有限公司，贵州仁怀 564501）

在酱香型白酒生产过程中对酒醅中乙醇的监测是了解酒醅发酵状态的重要参数之一。酒醅中乙醇测定结果的准确性直接关系到酿造过程酒醅发酵状态的判断，及时、准确的检测结果可为生产指导提供有效的数据支撑。选择一种准确、快速、稳定的乙醇检测方法对酿酒生产指导非常重要。目前对于乙醇的检测方法有蒸馏法、气相色谱法、顶空气相色谱法、气相色谱质谱联用法等。GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》中给出了4 种酒中乙醇浓度的测定方法，包括蒸馏法和气相色谱法。针对酒醅中乙醇的测定目前无国家标准或行业标准，本文采用顶空气相色谱法，结合超声提取、冷冻高速离心技术，建立酱香型白酒酒醅中乙醇检测方法，该方法具有快速、准确、稳定、成本低等特点。

测量不确定度是质量控制的重要内容之一。测定不确定度是合理地表征赋予被测量值的分散性，与测量结果相联系的参数。测量不确定度的评定是评价实验室测定结果可信度的定量指标。目前有关乙醇含量测量不确定度评定主要集中在血液中乙醇含量测定，酒醅中乙醇含量的不确定度评定未见报道。本研究根据《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）、CNAS-GL05：2011《测量不确定度要求的实施指南》及CNASGL06：2019《化学分析中不确定度的评估指南》，对顶空气相色谱法（headspace gas chromatography，HS-GC）测量酒醅中乙醇结果的不确定度进行评定，分析不确定度来源，确定影响结果的主要因素，以期为实验室检测乙醇的准确性和可靠性提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器

酒醅样品：酱香型白酒出窖酒醅、堆积酒醅、窖内酒醅；乙醇（纯度≥99.9%），美国TEDIA公司。

仪器设备：顶空-气相色谱仪（配有氢火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID）），7697A-7890 B，美国Agilent 公司；离心机（MIKRO 220R），德国Hettich 公司；分析天平（XP205），梅特勒-托利多公司；实验室纯水系统，上海HHitech 公司；回旋振荡器（HZ-300），江苏科析仪器公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理

准确称取15.00 g酒醅置于50 mL离心管中，加入30 mL 超纯水，280 r/min 振荡15 min，超声提取5 min，4 ℃条件下8000 r/min 离心3 min，准确吸取4 mL上清液至顶空瓶中进顶空-气相色谱仪分析。

1.2.2 标准溶液配制

准确称取2.5 g乙醇，用超纯水定容至50 mL容量瓶中,摇匀即得质量浓度为50.0 g/L 乙醇标准储备液，4 ℃冰箱中保存备用。用超纯水逐级稀释标准储备液，得到质量浓度梯度为0.5 g/L、1.0 g/L、2.5 g/L、5.0 g/L、10.0 g/L、15.0 g/L的标准工作溶液。

1.2.3 仪器条件

气相色谱条件：色谱柱：DB-FFAP（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度160 ℃；载气为氮气；柱流量2 mL/min；分流比：80∶1；升温程序：40 ℃，不保持，10 ℃/min 升温至90 ℃，不保持，30 ℃/min 升温至180 ℃，保持2 min；氢火焰离子化检测器（FID）条件：温度250 ℃；氮气流量30 mL/min；空气流量400 mL/min；尾吹气流量25 mL/min。顶空（Agilent 7697A）进样条件：加热箱温度45 ℃；传输线温度110 ℃；定量环温度80 ℃；平衡时间6 min；进样持续时间0.5 min；样品瓶振荡频率18次/min；样品瓶填充压力15 psi。

1.2.4 测量数据模型

酒醅样品中乙醇含量按下列公式计算：

Y=(C×V)/M（1）

式中：Y——样品中乙醇含量，g/kg；

C——测试溶液中质量浓度，g/L；

V——提取被测组分的超纯水体积，mL；

M——样品称取量，g。

1.2.5 测量不确定度来源分析

根据《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012），从数学模型和试验步骤分析，顶空气相色谱法测定酱香型白酒酒醅中乙醇含量的不确定度主要来源：（1）乙醇标准储备液配制；（2）乙醇标准溶液配制；（3）乙醇标准曲线拟合引入的不确定度；（4）样品称量引入的不确定度；（5）实验回收率引入的不确定度；（6）酒醅样品重复测定引入的不确定度。

图1 顶空气相色谱法测定酱香型白酒酒醅中乙醇含量的不确定度来源

2 结果与分析

2.1 标准储备液配制引入的不确定度

2.1.1 乙醇标准物质纯度引入的不确定度

2.1.2 标准物质称量引入的不确定度

2.1.3 标准储备液配制引入的不确定度

则合成得到乙醇标准储备液配制产生的相对标准不确定度u(S)为：

2.2 乙醇标准溶液配制引入的不确定度

由1.2标准溶液配制方法可知，用1 mL和5 mL移液器移取0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL 储备液于10 mL 容量瓶中并定容，可配得标准系列溶液为0.5 g/L、1.0 g/L、2.5 g/L、5.0 g/L、10.0 g/L、15.0 g/L。该部分使用的量器有移液器和容量瓶，测量不确定度由移液器和容量瓶引入。

乙醇标准系列溶液配制过程中一共用到1 mL移液器4 次，5 mL 移液器2 次，10 mL 容量瓶6 次，则相对标准不确定度u(V)为：

2.3 标准曲线拟合引入的不确定度

按照试验方法，分别配制6 种不同质量浓度的标准系列溶液，使用顶空气相色谱法进行测定，每个浓度3 个平行，得到乙醇标准物质峰面积（见表1），采用最小二乘法进行线性拟合，得到标准曲线（见图2），建立线性回归方程y=81.626x+1.1165，R²=0.999。取1 份酒醅样品，进行3 次重复检测，测定结果见表2。根据参考文献，标准曲线拟合引入的不确定度按式（2）、式（3）计算，结果如表3所示。

图2 乙醇标准工作曲线

表1 乙醇标准曲线数据

表2 酒醅样品测定结果

表3 拟合标准曲线引入的不确定度分量

式中：a——标准曲线斜率；

p——样品的测定次数，p=3；

n——标准系列溶液重复测定总次数，n=18；

S——标准曲线的标准偏差；

C——标准系列溶液的实测质量浓度，g/L。

2.4 样品称量时引入的相对不确定度

2.5 实验回收率引入的不确定度

酱香型酒醅中70 %以上为高粱颗粒，样品前处理过程未粉碎或未均质，使目标物提取可能不完全；酒醅样品中富含有机酸、糖类物质、脂类物质等，提取液色泽深、基质复杂，检测过程易存在基质效应。使用回收率可以判断样品提取效率以及是否存在基质效应等。平行称取样品3 份，加入乙醇标准品，按1.2 方法进行前处理后进顶空气相色谱仪检测。加标回收试验结果见表4，则不确定度u(F)由下式计算。

表4 加标回收结果及不确定度

2.6 测量重复性引入的相对标准不确定度

表5 重复性试验结果

2.7 合成标准不确定度评定

各个标准不确定度分量量值和贡献度见表6。合成相对标准不确定度为：

表6 顶空气相色谱法测定酒醅中乙醇的不确定度量值和贡献度

2.8 扩展不确定度评定及结果表示

取包含概率95 %，包含因子k=2，则酒醅中乙醇含量测定的扩展不确定度为：

当酒醅中乙醇检测结果为24.81 g/kg 时，不确定度表示为(24.81±1.24) g/kg，包含因子k=2，包含概率P=95%。

3 结论

通过对酱香型白酒酒醅中乙醇含量测定方法不确定度的评定，当检测结果为24.81 g/kg 时，扩展不确定度为1.24 g/kg。通过此次评定，得出乙醇测量过程中各分量及其贡献度为：标准溶液配制24 %，测量重复性20%，标准曲线拟合20 %，实验回收率12 %，样品称量3 %，标准储备液配制2%。标准溶液配制、测量重复性和标准曲线拟合是引入不确定度的主要因素。因此在测定酒醅中乙醇含量实验过程中，要使用已检定合格的移液枪和容量瓶，严格规范标准溶液系列配制操作，同时可增加平行样品检测次数、加强检测人员技能培训，旨在减少测量结果的不确定，保证结果的准确度。

图3 各类不确定度分量的占比