青正龙，刘学铭，唐道邦，林耀盛，王旭苹，杨怀谷，邹金浩，程镜蓉

（广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，农业农村部功能食品重点实验室，广东省农产品加工重点实验室，广东广州 510610）

肉制品的风味是影响消费者购买意向最为重要因素之一[1]。影响肉制品风味的因素众多[2]，如蛋白质与脂质的氧化降解、微生物的内源酶的作用等。就蛋白质而言，除了能通过自身的降解产生游离氨基酸、5'-核苷酸等风味物质或参与美拉德反应外，它还可以通过对风味化合物进行吸附而改变肉制品的风味[3]。在风味化合物的吸附过程中，蛋白质与风味化合物之间的结合（主要包括共价结合和非共价结合）通常被认为是影响食品风味的重要途径，近年来受到广泛关注[4-6]。

食用菌由于其丰富的鲜味物质和营养价值，其在肉制品行业中的应用近年来受到广泛的关注[7-9]。草菇是一种热带亚热带食用真菌，在东南亚地区深受消费者的喜爱[10]。当前，草菇在肉制品中的应用研究主要集中在分析草菇对产品风味品质的变化[11-12]，而对风味变化的机理研究得较有限。课题组前期研究表明，草菇加入肉糜后肉制品的风味物质可以得到提升[13]，但草菇与肉糜蛋白间的相互作用对肉糜蛋白风味吸附能力的影响规律及其潜在机理尚不明确。利用化学试剂（尿素、盐酸胍、硫酸钠等）破坏蛋白分子间的作用力是用来探究蛋白质对风味物质吸附过程的分子机理的常用方法[4-6]。鉴于此，本文尝试以草菇提取液和牛肉肌原纤维蛋白（Myofibrillar protein；MP）为研究对象，选取了六种在草菇和牛肉中具代表性的风味化合物（辛醛、苯甲醛、苯乙醛、2-庚酮、1-辛烯-3-醇和D-柠檬烯[12]），使用尿素、盐酸胍、β-巯基乙醇和丙二醇四种蛋白分子作用力破坏剂对样品进行处理，以明确牛肉MP 在风味吸附过程中的主要作用力，并尝试解析草菇提取液对MP 风味吸附能力的影响规律及机理，以期为草菇提取液在肉制品风味品质改良方面的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

草菇（Volvariella volvacea）、牛肉（牛外脊肉）广州市澳之星超市；辛醛、苯甲醛、苯乙醛、2-庚酮、1-辛烯-3-醇、D-柠檬烯、尿素、盐酸胍、丙二醇、β-巯基乙醇等 均为色谱纯，中国国药集团有限公司。

T25D 均质机 德国IKA 集团；TGL-16M 冷冻高速离心机 湖南湘仪仪器有限公司；57328-U 固相萃取装置 美国Supelco 公司；6890N/5975B GCMS 气相色谱联用仪 美国Aglient 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 草菇提取液制备 新鲜草菇于37 ℃恒温烘干至恒重后粉碎，使用20 目聚乙烯筛子过筛，过筛后草菇干粉于4 ℃避光保存备用。准确称取0.3 g 草菇干粉加入9.7 g 0.5 mol/L 的磷酸缓冲液（PBS；pH7.4）漩涡混匀，室温（25±2 ℃）振荡30 min。8000 r/min 离心5 min，上清液使用中速滤纸过滤，滤液视为草菇提取液。

1.2.2 MP 提取 牛肉MP 的提取参照周昌瑜等[14]的方法，稍作改动。牛外脊肉剔除可见的脂肪和结缔组织后，使用家用搅碎机将其破碎成肉糜。称取25 g 肉糜加入100 mL 的僵直液（0.1 mol/L NaCl，23.1 mmol/L Na3PO4，4.3 mmol/L MgCl2，1.1 mmol/L EDTA-2Na；pH7），10000 r/min 均质1 min 后4000 r/min离心5 min，保留沉淀。再次加入100 mL 僵直液，重复上述步骤三次，最后保留沉淀。沉淀中加入100 mL 0.1 mol/L 的NaCl 溶液，10000 r/min 均质1 min 后4000 r/min 离心5 min，重复操作3～5 次，每次保留上清液。所得上清液经两层纱布过滤，收集所有滤液，调整滤液pH 至6 左右，静置10 min（以出现絮状沉淀为准），4000 r/min 离心5 min，收集膏状残留物，所得膏状沉淀视为纯化后的MP。所得MP 膏状物置于100 mL 离心杯中均质，混匀后保存于碎冰中备用，并于48 h 内使用。

1.2.3 样品制备 称取1 g MP，加入4 mL 草菇提取液漩涡混匀后，在10000 r/min 下均质30 s；随后将样品置于4 ℃冰箱静置12 h 后，12000 r/min 离心20 min，保留沉淀，加入4 倍质量的0.5 mol/L 的PBS 洗涤沉淀，再次离心（12000 r/min，20 min），重复洗涤3 次。对照组以PBS 代替草菇提取液。

为研究草菇处理后蛋白质分子间作用力变化，将上述得到草菇处理组（MP+提取液）及对照组（MP+）各分为5 份，分别使用0.5 mol/L 的PBS、4 mol/L 的尿素、1 mol/L 的盐酸胍、20%的丙二醇和0.15 mol/L的β-巯基乙醇将上述得到的MP 稀释至5 mg/mL，草菇提取液处理批次样品依次标记为MP+提取液、MP+提取液+尿素、MP+提取液+盐酸胍、MP+提取液+丙二醇和MP+提取液+β-巯基乙醇，未经草菇提取液处理的样品依次标记为MP+、MP+尿素、MP+盐酸胍、MP+丙二醇和MP+β-巯基乙醇。将上述样品于4 ℃保存，用于后续实验。MP 的浓度以牛血清白蛋白为标准品，采用双缩脲法[15]测定。所有组别溶剂均为PBS（pH7.4）。

1.2.4 风味吸附能力测定

1.2.4.1 气质联用样品制备 辛醛、苯甲醛、苯乙醛、2-庚酮、1-辛烯-3 醇和柠檬烯分别使用少量甲醇溶解，再使用蒸馏水将各风味成分分别稀释至目标浓度。其中，苯甲醛浓度为50 mg/kg，苯乙醛为2500 mg/kg，辛醛为250 mg/kg，2-庚酮为150 mg/kg，1-辛烯-3-醇为500 mg/kg，D-柠檬烯为2500 mg/kg。取5 mL 1.2.3 中制备的样品置于20 mL 的顶空萃取瓶中，空白组为5 mL PBS，然后加入200 μL 上述浓度的风味化合物，漩涡震荡10 s，4 ℃平衡10 h 后进行下一步实验。

1.2.4.2 顶空固相微萃取（Solid phase headspace extraction；SPME）参照徐梓焓等[16]的方法，略作修改。将固相微萃取针插入顶空萃取瓶，伸出内部萃取探头（75 μm（CAR/PDMS））对游离的风味化合物进行萃取，萃取温度35 ℃，萃取时间30 min。随后，将萃取纤维针插入进样口（220 ℃）脱附5 min，不分流进样。

1.2.4.3 固相色谱-质谱（GC-MS）条件 参照蒋平香等[17]的方法，略作修改。升温程序：38 ℃条件下保持4 min，然后以5 ℃/min 的速度升温至130 ℃，再以15 ℃/min 的速度升至180 ℃。进样口温度：250 ℃；载气：高纯氦气；流速：1 mL/min。质谱条件：电子轰击（EI）离子源；电子能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；扫描范围：29～400 m/z；色谱柱：DB624（30 m×0.25 mm×1.4 μm）。GC-MS 得到的峰谱图通过MassHunter谱库进行定性，正、反匹配度大于80（最大值为100）为有效结果。游离风味化合物的比例计算公式如下所示：

式中：AC为空白组中的自由风味化合物的峰面积；AS为各实验组中的自由风味化合物的峰面积。

1.3 数据处理

实验数据的处理和作图软件分别为Excel 2010和Origin 9.0，使用软件SPSS 22 对数据进行显著性差异分析（P＜0.05）。进行3 次独立实验，每组实验设定3 个平行，结果表示为平均值±标准差。

2 结果及分析

2.1 尿素处理下草菇提取液对MP 风味吸附能力的影响

尿素是一种常用的蛋白质变性剂，它可以通过破坏疏水相互作用和氢键使蛋白质变性[18]。从图1可以看出，相较于MP+体系，MP+尿素体系中游离的辛醛、苯乙醛、2-庚酮、1-辛烯-3-醇和D-柠檬烯显著增加（P＜0.05）。特别地，MP+体系中游离的辛醛、2-庚酮、1-辛烯-3-醇和D-柠檬烯百分比分别为24%、84.97%、82%和76.63%。而MP+尿素体系中游离的辛醛、2-庚酮、1-辛烯-3-醇和D-柠檬烯百分比分别提高到179.71%、129.46%、107.16%和142.87%。即尿素处理后的MP 对辛醛、2-庚酮、1-辛烯-3-醇和D-柠檬烯的结合由原来的吸附作用（游离的风味化合物百分比小于100%）转变为释放作用（游离的风味化合物百分比大于100%），这表明MP 对以上风味化合物成分吸附主要取决于疏水相互作用和氢键作用。Kun 等[6]研究植物蛋白与风味化合物的结合时也发现，醛类与蛋白质的氨基（-NH2）和巯基（-SH）可以通过疏水相互作用结合。酮和醇与蛋白质之间容易发生疏水相互作用[19]，因此MP 在疏水作用力减弱后对2-庚酮和1-辛烯-3-醇吸附能力的下降。D-柠檬烯作为极性分子，在体系中游离百分比的降低可能是基于同样的原因。另一方面，MP 的非共价键被破坏虽然并未导致MP 对苯乙醛的吸附行为转变为释放行为，但MP 对苯乙醛的吸附能力显著下降（P＜0.05），这表明非共价键在维持苯乙醛和MP 的结合中发挥了重要作用。

图1 尿素处理下草菇提取液对MP 风味吸附能力的影响Fig.1 Effects of VV on MP flavor adsorption capacity under urea

草菇提取液处理前后MP 对风味化合物的吸附有显著变化。如图1 所示，MP+和MP+提取液体系中游离辛醛、苯乙醛、1-辛烯-3-醇和D-柠檬烯浓度的差异并不显著，这可能是因为MP 对这几种风味化合物的吸附已饱和[20]。尿素处理后，MP 对辛醛、2-庚酮、D-柠檬烯均表现为释放行为，但MP+提取液+尿素体系中MP 对辛醛、2-庚酮、D-柠檬烯的释放作用较对照组（MP+尿素）明显减弱。具体来看，三者吸附能力由179.71%、129.46%和142.87%分别下降至109.64%、104.65%和102.81%，说明草菇提取液有效缓解了尿素对MP 中疏水相互作用力或氢键的破坏。这表明草菇提取液可能通过增强MP 疏水相互作用力或氢键来影响MP 对辛醛、苯乙醛、2-庚酮和D-柠檬烯的吸附。

2.2 盐酸胍处理下草菇提取液对MP 风味吸附能力的影响

盐酸胍（Guanidine hydrochloride，GuCl）作为一种蛋白变性剂可以削弱蛋白中的疏水相互作用力、氢键和离子键等非共价键[21]。如图2，盐酸胍处理后，样品的游离的辛醛、苯乙醛、2-庚酮、1-辛烯-3-醇和D-柠檬烯百分比均较未处理组显著增加，这与尿素处理后的变化趋势一致，进一步证实了以上风味物质与MP 的相互作用中非共价键（疏水相互作用力、氢键和离子键）的贡献。非共价键被破坏后，游离苯乙醛的增加较其它几种风味物质更低，这可能是苯乙醛与MP 的结合除了非共价结合外还存在其他因素的影响。

图2 盐酸胍处理下草菇提取液对MP 风味吸附能力的影响Fig.2 Effects of VV on MP flavor adsorption capacity under guanidine hydrochloride

在MP+提取液体系中，游离的2-庚酮和1-辛烯-3-醇分别为76%和75.5%，低于MP+体系中的82.41%和81.6%，这表明草菇提取液促进了MP 对2-庚酮和1-辛烯-3-醇的吸附。这一趋势与尿素溶剂体系相一致。值得注意的是，盐酸胍处理下，草菇提取液对MP 吸附风味物质（辛醛、苯甲醛、苯乙醛和D-柠檬烯）的能力并未表现出显著影响，而对2-庚酮和1-辛烯-3-醇的吸附能力（119.12%和117.61%）较MP+盐酸胍组（107.25%和92.4%）有所提高，这一趋势则与含有尿素的体系相反。与本研究结果相似地，汪娟[22]在研究中发现盐酸胍处理后的大豆蛋白对1-辛烯-3-醇的吸附能力同样有所下降。一般地，盐酸胍与尿素的主要区别是盐酸胍可以破坏蛋白质中的非共价键，包括疏水互作用力、氢键和离子键，而尿素则主要破坏蛋白中的疏水相互作用力或氢键[22]。因此这一趋势的变化可能是由离子键被破坏引起的，即MP 对2-庚酮和1-辛烯-3-醇的吸附能力中，离子键也起了部分作用。另一方面，带有胍阳离子的盐酸胍可以通过氢键附着于蛋白上[23-24]，使MP 表面负电荷强度降低，导致MP 对2-庚酮和1-辛烯-3-醇吸附能力的下降。

2.3 丙二醇处理下草菇提取液对MP 风味吸附能力的影响

丙二醇（Propylene glycol，PG）作为一种有机试剂可以削弱蛋白间的疏水相互作用力，但与尿素和盐酸胍不同的是，它还可以增强氢键和离子键[21]。因此，它可以作为一种有效检测蛋白质和风味化合物之间氢键、离子键以及疏水相互作用的试剂[25]。与含有尿素和盐酸胍溶剂体系相比，丙二醛处理后，样品中游离辛醛、苯乙醛、1-辛烯-3 醇的百分比显著降低。这表明，除了疏水相互作用外，氢键和离子键也参与了MP 和风味化合物的相互作用。与MP+和MP+提取液体系相比，丙二醛处理后样品中游离的辛醛、苯乙醛、2-庚酮和D-柠檬烯百分比都有不同程度的增加，这可能是因为MP 与以上风味物质的相互作用过程中，疏水相互作用力相较氢键和离子键贡献更大[26]。特别地，MP+丙二醇体系中游离的1-辛烯-3 醇百分比（71.43%）低于MP+体系（82%），这可能是1-辛烯-3 醇中极性的羟基可以通过氢键和离子键与蛋白质相结合导致的。芦曦[27]在研究大豆分离蛋白和柠檬风味化合物过程中认为醇类化合物与蛋白的结合过程中，氢键和离子键发挥主要作用。如图3所示，在含有丙二醇的体系中，MP 对2-庚酮的吸附行为转变为了释放行为，这表明2-庚酮与MP 的结合中疏水相互作用力的贡献要大于氢键或离子键的作用，这与Damodaran 等[19]的结论相一致。

图3 丙二醇处理下草菇提取液对MP 风味吸附能力的影响Fig.3 Effects of VV on MP flavor adsorption capacity under propylene glycol

草菇提取液处理前后MP 对风味物质吸附能力的区别如图3。比较MP+和MP+提取液体系，草菇提取液处理前后MP 对辛醛吸附无显著变化（P＞0.05）。但在MP+提取液+丙二醇中游离的辛醛百分比为52.94%，显著低于MP+丙二醇的57.86%（P＜0.05），这可能是因为草菇提取液改变了MP 的疏水作用力。与之相反地，在2-庚酮的吸附过程中，MP+提取液中游离的2-庚醛百分比为75.26%，显著低于MP+中的84.97%（P＜0.05）。而MP+提取液+丙二醇中游离的2-庚醛百分比为154.15%却显著高于MP+丙二醇（127.31%）（P＜0.05）。这可能是草菇提取液破坏了MP 的氢键和离子键，从而使MP 对辛醛和2-庚酮的吸附能力产生影响。

2.4 β-巯基乙醇处理下草菇提取液对MP 风味吸附能力的影响

β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME）作为一种常用的还原剂，常用于蛋白质中二硫键的还原[28]。如图4 是以0.15 mol/Lβ-ME 处理的体系中不同游离的风味化合物百分比。除苯甲醛外，β-ME 处理后样品游离的风味化合物百分比较对照组（MP 和MP+提取液组）显著提高（P＜0.05）。对于辛醛、苯甲醛、苯乙醛和2-庚酮，除了非共价结合外，它们的羰基基团还可与蛋白质的氨基（-NH2）和巯基（-SH）发生共价结合[6,29]。因此MP+β-ME 体系中游离的辛醛、苯甲醛、苯乙醛和2-庚酮的百分比显著（P＜0.05）高于MP+体系，这说明β-ME 破坏了这些风味物质与MP 的共价结合。楼宵玮等[30]在研究氯化钠对MP 和风味物质相互影响中，认为蛋白结构的变化会削弱MP 与醛酮类化合物结合形成席夫碱的能力，从而使MP 对风味化合物的吸附能力减弱，游离的风味化合物增多。对于1-辛烯-3 醇和D-柠檬烯，β-ME 可以通过还原MP 中的二硫键使MP 三级和四级结构发生改变[31]。因此在含有β-ME 的体系中，MP 对1-辛烯-3 醇和D-柠檬烯吸附能力的下降（游离的1-辛烯-3 醇和D-柠檬烯百分比上升）可能是MP 的结构改变引起的。

图4 β-巯基乙醇处理下草菇提取液对MP 风味吸附能力的影响Fig.4 Effects of VV on MP flavor adsorption capacity under β-mercaptoethanol

草菇提取液处理前后的MP 对风味化合物吸附能力的改变主要体现在辛醛、苯甲醛和苯乙醛这三种醛类。如图4，在未经β-ME 处理的样品中，除苯甲醛外，MP+和MP+提取液体系对醛类物质的吸附能力并未表现出显著区别（P＞0.05）。而在β-ME 处理后，MP+提取液+β-ME 体系中，游离的辛醛、苯甲醛和苯乙醛百分比分别为54%、55.25%和71.14%，显著低于（P＜0.05）MP+β-ME（84.23%、202.73%和107.46%）。表明在β-ME 的存在下，草菇提取液促进了MP 对醛类的吸附。这可能是因为草菇中的内源酶诱发了MP 分子内更多二硫键的形成[12]。而β-ME 的加入将二硫键还原为巯基，这一方面直接为醛类物质增加了结合位点，另一方面二硫键的破坏使蛋白结构展开，暴露了其它非共价结合和共价结合位点，从而使MP 对辛醛、苯甲醛和苯乙醛的吸附增加。以上结果表明，草菇提取液可能通过改变MP共价结合位点数和结构，从而影响MP 对醛类物质的吸附能力。

3 结论

本研究利用尿素、盐酸胍、丙二醇和β-巯基乙醇对草菇提取液处理后的MP 间作用力进行破坏，探究草菇提取液处理前后的MP 风味吸附能力及蛋白间作用力的变化。研究发现，选取的6 种风味物质与MP 的作用中，疏水相互作用力起到了关键的作用，其次是氢键、共价结合和离子相互作用。而草菇提取液可以通过增强MP 非共价键从而提高MP 对2-庚酮、1-辛烯-3-醇和D-柠檬烯的吸附能力，同时还可以通过对MP 共价键的影响，使MP 对苯甲醛的作用由释放转变为吸附。本研究尝试从MP 的作用力变化解析草菇对MP 风味吸附能力的影响，其研究结果有助于阐明草菇改善肉制品风味的作用机理，为草菇在风味肉制品开发中的应用提供理论依据。