郑志聪，麦彩园，王 斌

（1. 佛山市三水区妇幼保健院外科，广东 佛山 528100 ；2.广东省妇幼保健院妇产科，广东 广州 510010 ；3. 佛山市三水区人民医院外科，广东 佛山 528100）

乳腺癌是女性群体中发病率最高的恶性肿瘤。每年有数以万计的女性死于乳腺癌，且近年来此病的发病率逐年升高[1]，此病患者的发病年龄呈年轻化的趋势[2]。有效治疗乳腺癌是一个亟待解决的问题[3]。近年来在乳腺癌的治疗方面不断涌现出先进的治疗方法，引入分子基因特征平台管理乳腺癌有助于更有效地治疗此病，降低此病患者的死亡率[4]。MicroRNA（miRNA）是一种非编码RNA 分子，能与互补碱基配对，识别并直接调控靶基因，影响其翻译，进一步实现转录后调控[5]。miRNA 能显著促进细胞的正常生长，维持细胞的功能，miRNA 表达的变化与癌症有着密切的关系[6]。目前已证实，miRNA 可抑制肿瘤[7]。降低miR-16-5p 可促进乳腺癌的生长[8]。NOD 样受体蛋白1（nod like receptor proein 1，NLRP1）是最早被发现的炎性体，可通过对先天性和适应性免疫、细胞凋亡、分化的调节而在肿瘤的发生中发挥致病作用[9]。MiRNA-16-5p 可通过靶向NLRP1 来抑制白细胞介素-1β（IL-1β）、细胞介素-18（IL-18）的表达，从而改善缺氧复氧引起的BRL-3A 细胞焦亡[10]。基于以上背景，本文欲探讨miR-16-5p 靶向调控NLRP1对抑制乳腺癌增殖的分子机制。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂

紫外分光光度计、PCR 检测系统、双荧光素酶报告检测系统、电泳仪、转膜仪，以上仪器均由美国Progmega 公司生产。RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒、Trizol 液、引物、CCK-8 溶液，以上试剂均由中国爱必信生物科技有限公司生产。BCA 蛋白定量试剂盒、载体、培养液，以上试剂均由中国Takara 公司生产。Western-Blotting 的一、二抗体，由美国abcam 公司生产。质粒抽提试剂盒、miR 模拟物及对照物、NLRP1 过表达载体、Trizol 试剂，以上试剂均由中国铎洋生物有限公司生产。

1.2 研究对象

1.2.1 病例信息 本研究收集广东省妇幼保健院、佛山市三水区人民医院2018 年12 月至2021 年12 月期间经手术切除的乳腺标本60 份，将其中30 份正常乳腺标本设为正常组，将其中30 份乳腺癌标本设为癌症组。这60 份乳腺标本取自60 例患者，这些患者的年龄为50 ～52 岁，体重为50 ～52 kg。所有患者的年龄、体重差异不大。本研究的整个研究过程经患者同意并经广东省妇幼保健院、佛山市三水区人民医院的医学伦理委员会授权。

1.2.2 纳入及排除标准 入组标准：纳入病例的活动能力、民事行为能力均正常，无精神疾病及认知功能障碍；癌症初发，未经放化疗、免疫治疗等；癌症组织经病理学检查被确诊为乳腺癌组织，正常乳腺组织经病理学检查被确诊为正常乳腺组织。排除标准：男性乳腺癌患者；合并有严重的慢性疾病；合并有内分泌疾病等代谢异常性疾病。

1.2.3 标本收集 术中将乳腺癌组织、正常乳腺组织（取癌灶远端距癌灶3 cm 以上的正常乳腺组织）切除后，用专用的镊子将所有组织取出，立即用焦碳酸二乙酯（DEPC）液对组织进行冲洗，并由专业人员放入冷藏管中，用液氮进行冷冻，然后在病理科收集临床数据。

1.3 研究方法

收集经手术切除的乳腺癌组织（癌症组）、正常乳腺组织（正常组），提取细胞进行培养、传代。采用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）法检测miR-16-5p、NLRP1 在正常组、癌症组细胞中的表达，采用CCK-8 法检测癌症组细胞中miR-16-5p、NLRP1 的增殖情况，采用RT-qPCR 法检测癌症组细胞中miR-16-5p 过表达后miR-16-5p、NLRP1 的相对表达情况，采用蛋白免疫印迹（Western Blotting，WB）法检测癌症组细胞中miR-16-5p 过表达后NLRP1 的表达情况，采用双荧光素酶报告基因实验测定miR-16-5p 可能结合的靶位点NLRP1。

1.4 实验步骤

1.4.1 细胞提取、培养、传代 取样品，解冻。去掉组织中的结缔组织，剪碎，用1% 的胰酶消化，孵育30 min 后用移液管反复吹打，用70 μm 孔径的细胞筛过滤，除掉大块未消化的团块。将得到的滤过液进行离心处理，取沉淀物，并用含10%灭活胎牛血清（FBS）、100 μ/mL 青霉素和100 μ/mL 链霉素的RPMI 1640 培养基对沉淀物进行培养。将标本与DMEM 培养液混合后进行离心处理，去上清。重悬细胞，在悬液中缓慢注入Percoll 分离液，经离心处理后吸取中层细胞，加入培养基。于培养箱中进行培养，每2 d 或3 d 更换1 次培养液。在显微镜下观察细胞。用胰酶对细胞进行消化，调节细胞浓度至2×105 个/mL，继续在培养板内培养细胞，当细胞融合度达到90%时开始进行细胞传代。

1.4.2 细胞转染 miR-16-5p 模拟物（mimics）和相应的阴性对照（NC）的细胞密度均为5×105，将其铺于六孔板上，融合度达到90% 后吸出，用PBS 缓冲液冲洗，更换为Opti-MEM 培养液，每孔加入3 mL，稀释质粒至20 μm。将RNA 加入到转染试剂中孵育，并置于培养液中培养6 h，之后采用普通培养液培养48 h，最后检测其表达量。

1.4.3 RT-qPCR 根 据Trizol 液 说 明 书， 取 样品， 在 含RNAiso Plus 液 的EP 管 中 混 合， 加 入氯仿，在4 ℃下进行离心处理，在上层水相中加入异丙醇，混合并进行离心处理。去上清液，加入乙醇。再去上清后加入无RNA 酶水，计算OD值。 参 照OneStep PrimeScript®miRNA cDNA 合成试剂盒的说明书，进行反转录，合成cDNA，然后 用SYBR Green I 荧 光 法 进 行PCR 检 测（ 参 照SYBR GreenI 说 明 书）。miR-16-5p 引 物 序 列：F:5 ′ -TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3 ′，R:5 ′ -TGCGTGTCGTGGAGTC-3 ′ ；NLRP1 引物 序 列：F:5 ′ -TCTGAGTGATGAGATGAG-3 ′，R:5′ -GTGAGGATGTGCTATTAC-3′ ；U6 引 物 序列F:5 ′ -CTCGCTTCGGCAGCACA-3 ′，R:5 ′ -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′ ；β-actin 引 物 序列F:5′ -TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3′，R:5′ -TGATGTCACGCACGATTT-3′。2-ΔΔCT用于计算待测样品的相对浓度。同样的实验重复3 次，取平均值（U6是miR-16-5p 的内参，β-actin 是NLRP1 的内参）。

1.4.4 细胞增殖检测（CCK-8 法） 将第3 代细胞制备成细胞悬液并计数。在96 孔板中接种细胞悬液，每孔约接种100 μL，重复3 次。将培养板置于培养箱中预培养2 ～4 h（培养条件是：37℃，5%CO2），每孔各加入10 μL 的CCK-8 溶液，轻轻晃动培养板将其混匀。将培养板放入培养箱中孵育1 ～4 h。分别在0 h、24 h、48 h、72 h 时加入10 μL 的CCK-8试剂，在37℃下孵育120 min。最后用酶标仪读取相应因子的OD 值。

1.4.5 WB 法检测RIPA 蛋白的表达水平 根据目标蛋白的分子量，选择合适浓度的SDS/PAGE 凝胶。电泳后，将蛋白质转移到 PVDF 膜上，并采用正常免疫染色法进行染色。加入一抗（1:500 稀释）和二抗（1:1000稀释），分别在4℃下孵育过夜、37℃下孵育2 h，然后进行化学发光、增强、固定和拍照处理。每个实验重复3 次后取平均值（内参为β-actin）。

1.4.6 双荧光素酶报告基因实验测定miR-16-5p 可能结合的靶位点NLRP1 利用targetscan 网站预测miR-16-5p 可能结合的靶位点NLRP1。构建WT质粒+miR-16-5p mimics+pRL-TK 质粒（野生型）、MT 质 粒+miR-16-5p mimics+pRL-TK 质 粒（ 突 变型）；WT 质 粒+negative control+pRL-TK 质 粒；MT质粒+negative control+pRL-TK 质粒。pGL3 启动子载体注射NLRP1 的突变序列，将细胞接种到24 孔板上，并用海肾荧光素酶载体pRL-TK 共转染，根据标准化转染效率的差异行荧光素酶检测。

1.5 统计学方法

用SPSS 20.0 软件和GraphPad 7.0 软件处理本研究中的数据，计量资料用±s表示，用t检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-16-5p、NLRP1 在正常组、癌症组细胞中的表达

miR-16-5p 的mRNA 在正常组细胞中的相对表达值为（3.76±0.21），在癌症组细胞中的相对表达值为（1.35±0.12），组间相比差异有统计学意义（P＜0.05）。NLRP1 的mRNA 在正常组细胞中的相对表达值为（4.88±0.11），在癌症组细胞中的相对表达值为（8.01±0.33），组间相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 癌症组细胞miR-16-5p 过表达后miR-16-5p、NLRP1 的表达情况

将miR-16-5p 过 表 达 转 染， 行RT-qPCR 实验，提示模拟物过表达转染后细胞miR-16-5p 的表达水平显著上升，相对表达值由（3.66±0.23）上升至（7.10±0.98），二者相比差异有统计学意义（P＜0.05）；NLRP1 的表达水平显著下降，相对表达值由（8.12±0.19）下降至（4.17±1.41），二者相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 miR-16-5p、NLRP1 过表达对癌症组细胞增殖的影响

经细胞增殖检测（CCK-8 法）发现，在癌症组细胞中过表达miR-16-5p 可减少细胞增殖（见图1A），在癌症组细胞中过表达NLRP1 可增加细胞增殖（见图1B）。

图1 miR-16-5p、NLRP1 过表达对癌症组细胞增殖的影响

2.4 癌症组细胞miR-16-5p 过表达后NLRP1 的表达情况

采用WB 法检测癌症组细胞中miR-16-5p 过表达后NLRP1 的表达发现，NLRP1 在miR-16-5p mimics 较miR-16-5p Control 明 显 降 低（ 内 参 为β-actin，P＜0.05）。见图2。

图2 癌症组细胞中miR-16-5p 过表达后NLRP1 的表达情况

2.5 miR-16-5p 可能结合的靶位点NLRP1

利用targetscan 网站预测发现，miR-16-5p 可能结合的靶位点为NLRP1。见图3。通过荧光素酶报告基因实验发现，miR-16-5p 可显著抑制WT 质粒+miR-16-5p mimics+pRL-TK 质粒（野生型）的荧光素酶活性， 而不影响MT 质粒+miR-16-5p mimics+pRL-TK 质粒（突变型）的荧光报告基因活性（P＜0.05）。见图4。

图3 targetscan 网站预测miR-16-5p 可能结合的靶位点

图4 荧光素酶报告基因实验结果

3 讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。近年来虽然乳腺癌患者的死亡率有所下降，其5 年生存率有所提高，但此病的发病率仍呈增高的趋势[11]。针对乳腺癌的靶向治疗是近年来乳腺癌治疗中的研究热点。乳腺癌中MicroRNA-16-5p 过表达后，可通过靶向血管内皮生长因子A（VEGFA）抑制肿瘤的增殖和侵袭，并引发肿瘤细胞凋亡[12]。miR-16-5p 是乳腺癌原发灶和转移灶组织中稳定表达的一种MicroRNA[13]。炎性小体是一种存在于细胞质内的多聚复合体，核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白家族（NLRPs）是炎性小体最为经典的一类[14]。在乳腺癌的发病机制中，NLRP1 可参与有丝分裂、突变、血管生成、细胞存活、免疫抑制和转移[15]。已有研究证实，MiR-16-5p 可通过靶向NLRP1 来控制细胞焦亡[10]。有研究在人乳腺癌组织中发现NLRP1 呈高表达，且与淋巴结转移、肿瘤淋巴结转移阶段及Ki-67 水平相关[16]。本研究的结果显示，癌症组细胞比正常组细胞miR-16-5p 的mRNA 相对表达值显著下降（P＜0.05）；癌症组细胞比正常组细胞NLRP1 的mRNA 相对表达值显著上升（P＜0.05）；癌症组细胞miR-16-5p 过表达后miR-16-5p 的表达水平显著上升、NLRP1 的表达水平显著下降（P＜0.05）。提示miR-16-5p 在乳腺癌中呈低表达，NLRP1 在乳腺癌中呈高表达。本研究的结果显示，miR-16-5p 可显著抑制WT 质粒+miR-16-5p mimics+pRL-TK 质粒（野生型）的荧光素酶活性，而不影响MT 质粒+miR-16-5p mimics+pRLTK 质粒（突变型）的荧光报告基因活性（P＜0.05）。进一步证明了miR-16-5p 与NLRP1 的靶向调控关系。

综上所述，miR-16-5p 在乳腺癌中呈低表达，NLRP1 在乳腺癌中呈高表达。miR-16-5p 可靶向调控NLRP1 而抑制乳腺癌的增殖。本研究为临床上治疗乳腺癌提供了新的思路和用药策略。