斜带石斑鱼BAG-1基因克隆及表达分析

2022-08-09吴子杰温依铭刘结红简纪常

南方农业学报 2022年5期

李星，吴子杰，温依铭，刘结红，蔡佳*，简纪常*

（1广东海洋大学水产学院，广东湛江 524088；2广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，广东湛江 524088；3广东省水产经济动物病害控制重点实验室，广东湛江 524088）

0 引言

【研究意义】斜带石斑鱼（）是我国南方沿海地区及东南亚各国的名贵海水养殖鱼类之一，其经济价值极高（王大鹏等，2012；张涛等，2018）。近年来，随着斜带石斑鱼高密度、集约化养殖规模的不断扩大，养殖环境日趋恶化，斜带石斑鱼养殖过程中细菌病和病毒病频繁发生，且病原感染能诱导产生多种细胞死亡，其形式包括凋亡、自噬和坏死（Georgiadis et al.，2001；Qin et al.，2003，2006；陈大玮等，2011）。BAG-1是筛选Bcl-2结合蛋白（Bcl-2-associated athanogene，BAG）时鉴定获得的第一个蛋白，其C端含有BAG结构域，能介导BAG家族蛋白的抗凋亡活性（Doukhanina et al.，2006）。因此，研究基因在斜带石斑鱼各器官组织中的表达特征，有助于了解斜带石斑鱼在病原感染后的免疫防御机制，为其病害防治提供新的策略。【前人研究进展】BAG-1可能参与鱼类应对病原入侵的免疫反应。细胞凋亡作为细胞程序性死亡的一种主要形式，已被证实在个体发育、损伤修复及病原清除等过程中扮演着重要角色（Yu et al.，2015），其过程主要受Bcl-2家族及相关蛋白的调控（Danial and Korsmeyer，2004）。BAG是一类抗凋亡蛋白家族，通过与Bcl-2相互作用而显著增强Bcl-2的抗凋亡作用，促进细胞存活（Takayama et al.，1995）。BAG-1可通过与Raf-1丝氨酸/苏氨酸激酶或Hsc70/Hsp70结合，促进细胞增殖（Pennell and Lamb，1997；Brive et al.，2001），且有研究证实外源刺激诱导的Hsp70表达可与Raf-1竞争性结合BAG-1，削弱Raf-1信号转导，从而抑制细胞增殖（Song et al.，2001）；BAG-1还可作为Hsc70/Hsp70 的核苷酸交换因子（NEF）刺激Hsc70 ATP水解，调节细胞的应激反应、凋亡、增生和迁移（Knee et al.，2001；李颖等，2009），并参与蛋白酶体降解途径与自噬间的切换，调节蛋白酶稳态（Minoia et al.，2014；Liu et al.，2020）。BAG-1的中心泛素样结构域（UBL）与26S蛋白酶体（Knee et al.，2001）可直接相互作用，促进蛋白酶体降解靶蛋白，还能与具有E3泛素连接酶活性的CHIP（carboxy ter‐minus of Hsp70 interacting protein）及Hsp70形成三元复合物降解靶蛋白，同时BAG-1通过依赖于CHIP的泛素化参与蛋白酶体调控，在此过程中BAG-1的泛素样结构域区可增强CHIP靶向蛋白的作用（魏瑞敏等，2016）。此外，人类巨细胞病毒（HCMV）感染胚胎肺细胞后，基因表达上调，而干扰基因表达能抑制HCMV的抗凋亡活性（Li et al.，2015），说明BAG-1在宿主抗病毒感染的免疫反应中发挥着重要作用；BAG-1在非小细胞肺癌组织中的阳性表达率明显高于肺脏良性病变组织，对于细胞病变也有一定的抑制作用（马家宝等，2009）。凋亡调控基因-1蛋白是基因的表达产物，与肿瘤的发生发展存在一定关联（陈小波和郑定容，2016）。Kermer等（2015）研究发现，过表达基因可显著降低α突触核蛋白突变体瞬时过表达对人类神经母瘤细胞产生的毒性效应。【本研究切入点】BAG-1作为抗细胞凋亡蛋白家族的成员之一，在细胞发育、增殖、分化及应激中发挥重要作用（Hückelhoven，2004；Watanabe and Lam，2006），但目前针对基因功能的研究主要集中在人类和高等脊椎动物，关于鱼类细胞死亡调控因子在病毒感染中发挥作用的报道相对较少，对鱼类基因的功能也知之甚少。【拟解决的关键问题】克隆斜带石斑鱼基因（）并对其结构特征、组织表达分布及在脂多糖（LPS）和聚肌胞苷酸（PolyI:C）刺激后的表达变化进行分析，进一步揭示鱼类BAG-1在病原感染中的作用机制，也为了解鱼类的抗病免疫提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试斜带石斑鱼购自湛江市东风水产市场，试验前1周暂养于实验室循环水系统中，活力良好，体表无伤。LPS和PolyI:C购自美国Sigma公司，Bio.analyzer 2100生物分析仪购自美国Agilent Technologies公司，PrimeSTAR HS DNA高保真聚合酶、Trans-Zol Up Plus RNA Kit、大肠杆菌DH5α感受态细胞及pMD18-T载体购自TaKaRa公司。

1.2 EcBAG-1基因克隆

1.2.1 引物设计与合成通过对转录组数据筛选获得基因EST序列，利用Primer Primer 5.0设计特异性引物（表1），并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 总RNA提取及cDNA合成根据TransZol Up Plus RNA Kit说明，分别提取斜带石斑鱼脾脏、肝脏、胸腺、头肾、鳃、皮肤、肌肉、大脑、外周血淋巴细胞和心脏等10种组织的总RNA，使用1.0%凝胶电泳检测其完整性，并以Bio.analyzer 2100生物分析仪检测总RNA浓度。参照反转录试剂盒说明反转录合成cDNA模板。

1.2.3基因克隆及载体构建根据斜带石斑鱼转录组数据，通过引物EcBAG-1-F/EcBAG1-R（表1）克隆基因，按PrimeSTAR HS DNA高保真聚合酶说明构建PCR反应体系50.0 μL：5×PrimeSTAR Buffer（MgPlus）10.0 μL，dNTP Mix‐ture 4.0 μL，上、下游引物（2.5 mmol/L）各2.5 μL，cDNA模板2.5 μL，PrimeSTAR HS DNA高保真聚合酶0.5 μL，ddHO 28.0 μL。扩增程序：98 ℃预变性5 min；98 ℃10 s，55 ℃5 s，72 ℃15 s，进行10个循环；98 ℃10 s，55 ℃5 s，72 ℃5 min，进行23个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物用1.0%琼脂凝胶电泳进行检测，目的条带使用凝胶回收试剂盒纯化回收，与pMD18-T载体连接后转化DH5α感受态细胞，37 ℃下倒置恒温振荡培养过夜，菌液PCR检测呈阳性的克隆送至广州生工生物科技有限公司测序。

表1 EcBAG-1基因克隆及实时荧光定量PCR扩增引物序列信息Table 1 Information of primer sequence used in the cloning and real-time fluorescent PCR of EcBAG-1 gene

1.3 生物信息学分析

利用ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找基因开放阅读框（ORF）及其推导氨基酸序列；使用SMART（http://smart.embl-hei‐delberg.de/）获取基因结构域；运用TMHMM Server v.2.0预测EcBAG-1蛋白跨膜结构域；通过SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/interactive）分别进行EcBAG-1蛋白二、三维结构预测；采用ExPASy（http://web.expasy.org/protparam/）预测EcBAG-1 蛋白理论等电点（pI）、分子量及亲水性参数等；在NCBI的Protein BLAST数据库中搜索与EcBAG-1氨基酸序列相似性较高的BAG-1氨基酸序列，使用ClustalX和MEGA 5.0进行多序列比对，并通过MEGA 6.0中的邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育进化树；运用PSORT Prediction（http://psort.hgc.jp/form.html）对EcBAG-1蛋白进行亚细胞定位预测分析。

1.4 LPS和PolyI:C刺激斜带石斑鱼

取暂养1周的健康斜带石斑鱼，采用腹腔注射法分别注射LPS（10 μg/mL）和PolyI:C（1 μg/mL），注射剂量0.1 mL/尾（Wei et al.，2017），对照组注射等量的PBS。注射0、6、12、24和48 h后分别从各处理组中随机采集5尾斜带石斑鱼的脾脏，提取RAN后反转录合成cDNA（方法同1.2.2），液氮速冻后-80 ℃保存备用。

1.5 EcBAG-1基因表达分析

通过实时荧光定量PCR对健康斜带石斑鱼各组织中的基因进行检测，以EcBAG-1-RT-F和EcBAG-1-RT-R为扩增引物，以为内参基因（表1）。实时荧光定量PCR反应体系10.0 μL：cDNA模板0.5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2×SYBR Green Mix（Roche）5.0 μL，双蒸水3.5 μL。扩增程序：95 ℃预变性10 s；95 ℃5 s，58 ℃15 s，72 ℃20 s，进行33个循环。每个样品设5个复孔，采用2法换算基因相对表达量（Livak and Schmittgen，2001），并以SPSS 20.0进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 EcBAG-1基因ORF序列分析结果

从斜带石斑鱼转录组数据中筛选获得基因EST序列，设计引物进行PCR扩增，经测序比对后得到基因ORF序列长624 bp，共编码207个氨基酸残基（图1）。EcBAG-1蛋白分子量为49.84 kD，pI为5.18，总平均疏水性为0.866，即EcBAG-1蛋白为疏水性蛋白。据SMART 4.0预测结果（图2）显示，EcBAG-1蛋白含有1个典型的家族结构域（BAG）和1个泛素结构域（UBQ）。TMHMM 2.0跨膜结构域预测结果表明，EcBAG-1蛋白不含跨膜结构域。通过PSITE对EcBAG-1蛋白进行功能位点预测，结果显示该蛋白含有1个酰胺化位点、2个异戊二烯基结合位点、3个微体C端靶向信号、4个蛋白激酶C磷酸化位点、5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、5个N-肉豆蔻酰化位点及1个真核硫醇蛋白酶组氨酸活性位点。EcBAG-1蛋白主要分布在细胞质和细胞核。

图1 EcBAG-1基因ORF序列及其推导氨基酸序列Fig.1 ORF and amino acid sequence induction of EcBAG-1 gene

图2 EcBAG-1蛋白结构域示意图Fig.2 EcBAG-1 protein domain diagram

2.2 EcBAG-1蛋白二、三级结构预测结果

SOPMA预测结果显示，EcBAG-1蛋白二级结构中α-螺旋（蓝色）占65.22%、延伸链（红色）占10.63%、无规则卷曲（紫色）占20.29%、β-转角（绿色）仅占3.86%（图3）。利用SWISS-MODEL对EcBAG-1蛋白三级结构进行预测，结果（图4）发现该蛋白氨基酸序列与人类的BAG-1氨基酸序列具有较高的相似性，故推测EcBAG-1具有类似的生物学功能。

图3 EcBAG-1蛋白二级结构预测结果Fig.3 Secondary structure prediction of EcBAG-1 protein

图4 人类BAG-1蛋白（左）与EcBAG-1蛋白（右）三级结构的比较Fig.4 Tertiary structure comparison of BAG-1 protein in human（left）and EcBAG-1 protein（right）

2.3 EcBAG-1氨基酸序列比对分析结果

使用ClustalX对EcBAG-1氨基酸序列与大黄鱼（）、斑马拟丽鱼（）、尼罗罗非鱼（）、牙鲆（）、红鳍东方鲀（）、红鲑鱼（）、斑马鱼（）、热带爪蛙（）、人类（）等物种的BAG-1氨基酸序列进行比对分析，结果（图5）显示，EcBAG-1氨基酸序列与大黄鱼的BAG-1氨基酸序列相似性最高（96.62%），与热带爪蛙的相似性最低（57.50%）。结合SMART及NCBI发现，以上物种氨基酸序列均含有BAG保守结构域，即BAG-1蛋白在以上物种中具有高度保守性。

图5 EcBAG-1氨基酸序列与其他物种BAG-1氨基酸序列的对比分析Fig.5 Comparative analysis of amino EcBAG-1 acid sequence with BAG-1 acid sequence in other species

2.4 系统发育进化树分析结果

基于BAG-1氨基酸序列相似性，通过MEGA 6.0中的NJ法构建系统发育进化树，结果（图6）显示，鱼类全部聚为一支，哺乳类聚为一支，而原鸡和热带爪蛙聚为一支。其中，斜带石斑鱼与大黄鱼（XP_019113087.1）的分类地位最近，其BAG-1氨基酸序列相似性达96.62%；与斑马拟丽鱼（XP_004542998.1）、尼罗罗非鱼（XP_003438109.1）、牙鲆（XP_0199666 54.1）、红鳍东方鲀（XP_003975493.1）、红鲑鱼（XP_029504482.1）、斑马鱼（NP_001092206.1）的亲缘关系较近，对应的BAG-1氨基酸序列相似性分别为89.86%、89.37%、89.86%、85.89%、82.61%和82.13%；与原鸡（NP_001103162.1）和热带爪蛙（XP_0029395 43.2）的亲缘关系相对较远，对应的BAG-1氨基酸序列相似性分别为58.45%和57.50%。

图6 基于BAG-1氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树Fig.6 Phylogenetic tree based on BAG-1 amino acid sequences similarity

2.5 EcBAG-1基因组织表达分析结果

采用实时荧光定量PCR检测健康斜带石斑鱼肝脏、胸腺、脾脏、头肾、鳃、皮肤、肌肉、大脑、外周血淋巴细胞及心脏等组织中的基因表达情况，结果（图7）表明，基因在以上组织中均有表达，且以在大脑中的相对表达量显著高于在其他组织中的相对表达量（<0.05，下同）。

图7 EcBAG-1基因在斜带石斑鱼不同组织中的表达情况Fig.7 Expression of EcBAG-1 gene of E.coioides in different tissues

2.6 EcBAG-1基因在病原感染后的组织表达特征

经LPS和PolyI:C感染刺激后，选取斜带石斑鱼脾脏组织进行进行基因表达检测分析，结果（图8）显示，2种刺激对基因在斜带石斑鱼脾脏中的表达均具有时效性。经LPS刺激6、24和48 h后，基因相对表达量均呈上调趋势，至刺激24 h时其相对表达量达最大值，但在刺激12 h时其相对表达量略有下调。经PolyI:C刺激6、12、24和48 h后，基因相对表达量均呈上调趋势，同样以刺激24 h时的上调幅度最大；与LPS刺激后的基因相对表达量相比，PolyI:C 刺激后基因相对表达量无明显的下调趋势。可以确定的是，在LPS和PolyI:C刺激24 h后斜带石斑鱼脾脏中的基因相对表达量显著上调。

图8 LPS和PolyI:C刺激后EcBAG-1基因在斜带石斑鱼脾脏中的表达情况Fig.8 Expression of EcBAG-1 in spleen of E.coioides after LPS and PolyI:C stimulation

3 讨论

本研究从本课题组前期构建的斜带石斑鱼转录组数据（张海艳等，2018）中筛选获得基因EST序列，利用Primer Primer 5.0设计特异性引物并成功扩增获得基因。基因共编码207个氨基酸残基，其编码蛋白含有BAG-1蛋白家族典型的BAG结构域和UBQ结构域，与已报道的BAG-1蛋白结构相同。通过BAG结构域，BAG-1能与丝氨酸/苏氨酸激酶Raf-1或Hsc70/Hsp70竞争性结合，BAG-1与Raf-1的结合可激活Raf-1及其介导的信号通路，从而促进细胞生长；Hsp70与BAG-1的结合则削弱Raf-1活化和信号转导，并抑制细胞生长（Doong et al.，2002）；UBQ结构域有利于BAG-1连接Hsc70/Hsp70与蛋白酶体，促进蛋白酶酶体降解多聚泛素化蛋白（Lüders et al.，2000），最终影响细胞的应激、生长及凋亡。PSORT Prediction预测结果显示，EcBAG-1蛋白主要分布在细胞质，故推测该蛋白具有调控细胞死亡与胞内信号转导的作用。氨基酸序列比对分析结果也显示，EcBAG-1氨基酸序列与其他物种的BAG-1氨基酸序列高度相似，说明EcBAG-1蛋白可能具有相似的生物学功能。在基于BAG-1氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树中，斜带石斑鱼与其他鱼类聚为一支，尤其与大黄鱼的亲缘关系最近。

在健康斜带石斑鱼体内，基因在检测的各组织均有表达分布，其中在大脑中的相对表达量最高，显著高于在其他组织中的相对表达量。哺乳动物基因功能研究显示，基因表达与创伤性脑损伤相关（Hayashi et al.，2000；Xu et al.，2012），还能调控神经元前体细胞增殖（Elliott and Ginzburg，2009），暗示基因可能具有类似的功能。经LPS和PolyI:C刺激后，斜带石斑鱼脾脏中的基因表达显著上调，表明该基因参与斜带石斑鱼抗病原感染的免疫反应。目前，有关的功能研究主要集中在人类和高等脊椎动物。由于BAG-1的表达水平与肿瘤分期及肿瘤细胞活性关联，因此可作为胃癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的生物标志物（Sauerbrei and Haeussler，2018），还可增强增殖和存活的主要调控因子——核激素受体活性（Ozfiliz et al.，2015）；利用原核表达获得的缓殖子特异性蛋白BAG-1建立间接ELISA，可实现对弓形虫慢性感染猪进行鉴别诊断（熊冰清，2012）。然而，针对鱼类基因的功能尚无研究报道。哺乳动物的基因研究发现，经LPS刺激后BAG-1与Hsp70的结合能介导核因子κB（NF-κB）p56亚单位的降解，从而抑制细菌感染引起的炎症反应（Tanaka et al.，2014）；在人类巨细胞病毒感染后基因表达上调，进而抑制该病毒诱导的细胞凋亡（Li et al.，2015）；在衣原体的感染中基因也具有相似作用（Du et al.，2013）。基因过表达还能激活人类多瘤性病毒JC病毒（Human polyomavirus JC virus）早期基因启动子的转录活性（Devireddy et al.，2000）。然而，近期有研究表明锯缘青蟹基因沉默能抑制对虾白斑病毒（White spot syndrome virus）的增殖及促进病毒感染诱导的细胞凋亡（Ma et al.，2019），说明基因可通过调控细胞死亡而参与宿主的抗病原感染免疫反应，因此推测基因也是通过类似的方式发挥作用，但具体原理有待进一步探究。