喻召雄，陶先法，贾 睿，侯诒然，李子万，董 寅，李 冰*，朱 健，，*

（1上海海洋大学水产与生命学院，上海 200120；2南京农业大学无锡渔业学院，江苏无锡 214000；3中国水产科学研究院淡水渔业研究中心/农业农村部稻渔综合种养生态重点实验室，江苏无锡 214081）

0 引言

【研究意义】稻虾共作模式是稻渔综合种养的典型模式之一，能达到“一田多用、一水多收”的效果，在湖北、江苏、江西、湖南和安徽等长江中下游地区广泛分布（陈松文等，2020）。土壤中的氮素大部分以有机氮形式存在，经过矿化作用转变为无机氮后才可被作物吸收利用。土壤有机氮矿化作用是除氮肥外作物获取氮素营养的主要途径，是表征土壤供氮潜力的重要指标（郝晓晖，2008；张笑千等，2010）。土壤有机氮矿化作用受多种因素影响，包括土壤有机氮含量、土壤微生物和底栖生物等（王伟等，2016）。因此，研究不同稻虾共作模式对土壤有机氮矿化作用的影响，明确虾类对土壤氮素矿化的作用机制，可为实际生产中氮肥的合理施用提供指导。【前人研究进展】稻虾共作模式下，虾类的残饵、粪便可参与稻田的有机质循环，提高土壤有机质含量，进而提升土壤整体肥力（管勤壮等，2019；杨智景等，2020）。稻田环境下，虾类是最主要的底栖生物，其扰动作用能增加土壤含水率，提升土壤中有机物的降解程度，进而改变土壤理化性质（龚世园等，2007；张雷等，2011；封功成等，2020）。佀国涵等（2020）研究表明，稻虾共作可显著提高微生物量碳和颗粒有机碳含量，对土壤中有机氮等有机质的降解有促进作用。而土壤微生物作为有机质最主要的分解者，其群落结构和活性也主要受土壤环境的影响（佀国涵等，2017；佀国涵等，2020）。王蓉等（2019）研究显示，稻虾共作显著增加了氨氧化古菌与氨氧化细菌的群落丰度，改变了群落结构组成，降低了氨氧化古菌群落多样性；郑娇莉等（2021）在长期稻虾共作养殖环境中筛选出6株芽孢杆菌有机质降解菌，能快速高效降解饵料培养基中的有机质。稻田耕层（0~20 cm）土壤富含氮素和有机质（吴颖琦等，2019；张锡州等，2000），也是生物活动的主要土层，因此关于有机氮矿化作用的研究多集中于该区域。高亚军等（2000）研究表明，免耕和常耕两种耕作方式下，10~15 cm土层的矿质态氮、微生物量氮、矿化势均显著低于0~5 cm土层；王根林等（2009）研究指出，可矿化氮随土层深度的增加而下降，在免耕表土层（0~7.5 cm）含量最高；顾春朝和傅民杰（2016）研究表明，稻田单施化肥能促进耕层表层（0~10 cm）土壤有机氮的氨化过程。【本研究切入点】虽然目前已有较多关于不同耕层有机氮矿化作用的研究报道，但关于耕层下部（10~20 cm）土壤有机氮矿化作用的研究较少，尤其缺乏稻虾共作模式下土壤有机氮矿化作用的相关研究。【拟解决的关键问题】研究2种稻虾共作模式对稻田耕层下部土壤有机氮矿化作用的影响及相关微生物对矿化作用的响应机制，为稻虾共生模式中虾类对土壤氮素肥力的影响机理研究及制定氮肥施用方案提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验点概况及试验材料

试验点位于江苏省靖江市（东经120°19′56.8″、北纬32°5′30.9″），年平均气温23 ℃，年平均降水量约1055 mm，属亚热带湿润季风气候。试验田为2020年5月末竣工的新建标准化稻田，土壤为油泥土，属渗育水稻土亚类渗潮粘田土属，质地均一，砂粘适中，基本理化性质：pH 7.3，全氮0.67g/kg、全磷0.24 g/kg、铵态氮24.62 mg/kg、硝态氮0.91 mg/kg。

试验用虾为红螯螯虾（）和罗氏沼虾（）；水稻品种为南粳5055。

1.2 试验方法

田间试验开始于2020年7月，采用防水布将试验田均分为6个小区，单个小区面积约700 m，设稻—红螯螯虾（RC）和稻—罗氏沼虾（RM）2种共作模式，每处理3个平行重复（图1）。试验期间，各小区独立运行，互不影响，水位高度一致。水稻于7月20号移栽，11月12日收获。移栽采用机插方式进行，株距间隔为10 cm。仅在水稻移栽前1 d施用水稻专用复合肥，施肥量为300 kg/ha，主要成分为N-PO-KO，总养分含量≥40%。虾苗于8月16日投放，红螯螯虾苗种均重约30 g/只，罗氏沼虾苗种均重约29 g/只；单个小区投放密度为22500尾/ha。虾苗于11月6日收获，收获前进行晒田，缓慢降低各小区水位高度，使红螯螯虾离开田面退回到环沟内。2种虾均为杂食性底栖生物，以水生植物、底栖无脊椎动物、藻类、碎屑喂食。其中，红螯螯虾有掘穴行为（黄智伟，2019），罗氏沼虾无掘穴行为（冯艺，2018）。

试验于9月1日开始，11月1日结束，为期60 d。养殖过程中每日投饵量为放养总重的2%（每隔20 d通过打样评估虾总重），投喂时间为每日下午17：00点，采用无人机对各小区红螯螯虾、罗氏沼虾进行投喂。

1.3 样品采集

在试验开始、结束时分别采集初期样本RC-1、RM-1和末期样本RC-2、RM-2。单小区选用五点取样法，用柱状采泥器采取耕层下部10~20 cm土壤，混合为1个样品。采集的土样去除作物根系等杂物，均匀分为3份。1份鲜土用于土壤微生物测定，其余经自然风干后过2 mm筛网，4 ℃保存，用于室内矿化培养试验和土壤全氮、铵态氮和硝态氮含量测定。

1.4 测定项目及方法

土壤全氮含量采用过硫酸钾消解—紫外分光光度法测定，土壤铵态氮含量采用氯化钾浸提—纳氏试剂分光光度法测定，土壤硝态氮含量采用氯化钾浸提—紫外分光光度法测定。

土壤样品经室内矿化培养后计算土壤有机氮的单周矿化量、累积矿化量、矿化势、一级反应速率和可矿化氮比例，培养方法采用改进的长期淹水密闭—间歇淋洗培养法（李文军等，2019）。其中，土壤氮素矿化速率采用一阶动力学模型计算（李慧琳等，2008）：

式中，为在时间内土壤氮素净矿化量（mg/kg），累积矿化量为各时期矿化产物NH-N含量之和，表示培养时间（d），为氮矿化势（mg/kg），k为氮素矿化一级反应速率［mg/（kg·d）］。矿化势指土壤潜在最大可矿化氮量；对同一土壤而言，其数值固定，不随土壤培养条件的变化而变化。数值按如下方法确定：另取各采样时期的土壤样本，于30 ℃下进行室内矿化培养，培养时间为120 d，将各时期测得NH

-N相加即为。

式中，TN为土壤全氮含量（mg/kg）。

土壤微生物群落组成测定：采用Fast DNA SPIN Kit（MP Biomedical，France）试剂盒提取土壤DNA，并用1%琼脂糖凝胶电泳对其进行检测；按指定测序区域，合成带有barcode的特异引物，采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Poly‐merase方法对基因组DNA进行PCR扩增，采用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收PCR产物，并用Tris HCl洗脱；将扩增产物委托上海凌恩生物科技有限公司完成Illumina PE250测序流程；将微生物序列信息根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤。

1.5 数据处理及统计分析

利用Usearch（vsesion 10）将优质序列聚类成操作分类单元（Operational Taxonomic Units，OTU），按照97%相似性对非重复序列（不含单序列）进行OTU聚类，得到OTU的代表序列；采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，使用Mothur 1.30.1在相似水平97%上进行微生物多样性指数评估；采用上海凌恩生物科技有限公司网上平台完成微生物主坐标分析（PCoA分析）。

利用SPSS 25.0对测定数据进行统计分析，利用GraphPad Prism 8.0.2绘图。

2 结果与分析

2.1 2种稻虾共作模式对耕层10~20 cm土层土壤氮素含量的影响

各时期土壤氮素含量变化如图2，在试验初期，2种模式间土壤全氮含量无显著差异（>0.05，下同），但RC模式的铵态氮和硝态氮含量显著高于RM模式（<0.05，下同）。试验末期，RC模式土壤全氮含量显著低于RM模式，铵态氮含量显著高于RM模式，硝态氮含量无显著差异。

与试验初期相比，试验末期时RC和RM模式的土壤总氮、铵态氮含量均明显下降，而硝态氮含量变化较小，且RC模式的土壤全氮含量下降幅度大于RM模式。

2.2 2种稻虾共作模式对耕层10~20 cm土层土壤有机氮矿化参数的影响

单周矿化量和累积矿化量变化曲线（图3）显示，连续淹水培养初期（0~14 d），RC-1、RM-1、RC-2和RM-2的单周矿化量均随培养时间的延长呈增加趋势，在第14 d达最大值，而后逐渐减小。20 ℃室内培养条件下，培养初、末期2种模式的累积氮矿化量表现为RC-2（131.21±2.12 mg/kg）>RM-2（119.85±1.36 mg/kg）>RC-1（91.27±2.96 mg/kg）>RM-1（76.00±1.16 mg/kg）。初、末期RC模式土壤累积氮矿化量均高于RM模式，且2种模式下试验末期土壤的累积氮矿化量较试验初期均明显上升。图4显示，初、末期RC模式矿化势、累积氮矿化量、可矿化氮比例均显著高于RM模式。末期土壤中的矿化势、累积氮矿化量、可矿化氮比例较初期均明显上升，一级反应速率升高，但仅RM模式达显著差异水平。

2.3 2种稻虾共作模式对耕层10~20 cm土层土壤微生物群落结构特征的影响

2.3.1 对稻田土壤微生物群落多样性的影响 Al‐pha多样性分析结果（图5）显示，RC-1与RM-1间OTU数目、Chao指数、Shannon指数、Simpson指数均无显著差异；RC-2与RM-2间Shannon指数和Simpson指数存在显著差异，Shannon指数RC-2低于RM-2，Simp‐son指数RC-2高于RM-2。结果表明，在试验初期，RC模式与RM模式优势菌群丰度、菌群多样性均无明显差异；而试验末期菌群多样性存在显著差异，RC模式显著低于RM模式。

2.3.2 对稻田土壤微生物群落组成的影响 门分类水平上，2种共作模式稻田土壤微生物群落组成较相似，但不同采样时期微生物组成有所差异。相对丰度≥1%的门类有16个，约占各样品序列总数的93.0%。由图6-A可看出，微生物门分类水平上相对丰度排前10的分别为变形菌门（Proteobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobiota）、酸杆菌门（Acidobacter‐iota）、粘菌门（Myxococcota）、脱硫杆菌门（Desulfo‐bacterota）、绿弯菌门（Chloroflexi）、硝化螺旋菌门（Nitrospirota）、拟杆菌门（Bacteroidota）、放线菌门（Actinobacteriota）和Unclassifild。其中，变形菌门为土壤中的最优势菌群，相对丰度为21.4%~26.7%；其次为酸杆菌门、放线菌门、绿弯菌门和拟杆菌门，相对丰度分别为13.0%~16.0%、6.1%~12.4%、9.7%~13.0%、4.3%~6.1%。微生物属分类水平上（图6-B），相对丰度≥1.0%的微生物菌属共有18个，约占样品丰度的35.0%，其中属于绿弯菌门的共有4个菌属，属于变形菌门的共有3个菌属，属于酸杆菌门的共有3个菌属，属于硝化螺旋菌门的共有2个菌属，剩余6个则属于其他门类。其中，为最优势菌属，相对丰度为2.4%~3.5%，其次为、、_及，相对丰度分别为1.0%~4.7%、2.1%~3.0%、1.5%~2.7%和1.8%~2.5%。

微生物群落结构主坐标分析结果（图7）显示，初期PCo1为38.65%，PCo2为18.56%，二者之和大于50%；末期PCo1为37.94%，PCo2为20.84%，二者之和大于50%；两个时期均具有代表性。在初期，RC模式与RM模式各样本位点在PCoA分析图上距离较接近，各位点之间连线所构成的区域有重叠部分，表明2种养殖模式间土壤微生物菌群结构较相似；而在末期，2种养殖模式各样本位点距离较远，无明显重叠区域，表明2种养殖模式间土壤微生物菌群组成结构明显不同。

在门分类水平和属分类水平上对相对丰度排前10的物种（Unclassified除外）的相对丰度数值进行-test检验，结果显示（图8-A），门水平上，试验初期RC模式酸杆菌门相对丰度显著低于RM模式，绿弯菌门相对丰度显著高于RM模式；末期RC模式脱硫杆菌门、硝化螺旋菌门相对丰度显著低于RM模式，而绿弯菌门、放线菌门相对丰度显著高于RM模式。在RC模式中，末期黏菌门、脱硫杆菌门、硝化螺旋菌门、拟杆菌门相对丰度均显著低于试验初期，而变形菌门、放线菌门相对丰度均显著高于初期；在RM模式中，硝化螺旋菌门、拟杆菌门相对丰度均显著低于初期，而变形菌门、绿弯菌门、放线菌门相对丰度均显著高于初期。

在属水平上（图8-B），试验初期RC模式uncultured、、、的相对丰度均显著低于RM模式，的相对丰度显著高于RM模式。试验末期RC模式uncultured、的相对丰度均显著低于RM模式，而的相对丰度显著高于RM模式。RC模式中，试验末期的相对丰度显著低于试验初期，而、的相对丰度显著高于试验初期；RM模式中，试验末期的相对丰度显著低于试验初期，而、的相对丰度显著高于试验初期。

门分类水平上，同一采样时期，2种模式之间相对丰度差异显著的微生物门类由初始期的2门（酸杆菌门和绿弯菌门）增加到末期的4门（放线菌门、脱硫杆菌们、粘菌门和硝化螺旋菌门）。属分类水平的变化与门分类水平类似，表现为相同采样时期2模式间有差异的菌属所对应的菌门由初期的4个门减少至末期的3个门。

2.3.3 土壤微生物类群与土壤氮矿化参数、土壤氮素的相关分析 对土壤微生物门分类水平（相对丰度前10）物种的相对丰度与土壤全氮、铵态氮、硝态氮、累积氮矿化量、矿化势、可矿化氮比例及一级反应速率进行相关分析（图9-A）。氮素含量相关性结果显示，全氮含量与拟杆菌门、脱硫杆菌门、粘菌门、硝化螺旋菌门呈极显著正相关（<0.01，下同），与放线菌门、绿弯菌门、变形菌门呈极显著负相关；铵态氮含量与拟杆菌门、硝化螺旋菌门呈极显著正相关，与脱硫杆菌门、粘菌门呈显著正相关，与放线菌门、变形菌门呈极显著负相关；硝态氮含量与各菌门均无显著相关性。矿化参数相关性结果显示，除一级反应速率外，累积氮矿化量、矿化势和可矿化氮比例与放线菌门、绿弯菌门、变形菌门呈极显著正相关，与拟杆菌门、脱硫杆菌门、粘菌门、硝化螺旋菌门呈极显著负相关。表明除疣微菌门外，土壤全氮和铵态氮含量会影响其余门类土壤微生物的相对丰度，且相关门类微生物均能显著影响土壤有机氮的矿化参数。

在属分类水平中（图9-B），、、与累积氮矿化量、矿化势、可矿化氮比例和一级反应速率均为极显著正相关；、与累积氮矿化量、矿化势、可矿化氮比例和一级反应速率均为极显著负相关；与累积氮矿化量、矿化势和可矿化氮比例为显著负相关，与一级反应速率无显著相关性；属仅与矿化势存在显著相关性；其余属类微生物与土壤有机氮矿化参数均无显著相关性。

3 讨论

水稻主要吸收土壤中的无机氮供自身生长发育需要，而有机氮需经微生物的矿化作用分解为无机氮后，才能被水稻吸收利用（武际等，2012）。研究表明，土壤中的有机氮经铵化作用和硝化作用后最终生成铵态氮和硝态氮（王艳杰等，2005），因此，土壤铵态氮和硝态氮含量在一定程度上可反映有机氮的矿化作用强度。本研究结果表明，RC模式下土壤铵态氮含量在初期、末期均显著高于RM模式，RC模式中土壤铵化作用更强。同时，初期2种模式间全氮含量无显著差异，而末期RC模式显著低于RM模式，表明红螯螯虾较罗氏沼虾更能促进土壤有机氮的矿化。而硝态氮主要靠铵态氮的硝化作用生成，但试验稻田长期处于淹水环境下，土壤硝化作用受到抑制，故初期、末期RC模式与RM模式间硝态氮含量无显著差异，且同一模式不同时期硝态氮含量也无显著差异，与李成芳等（2008）的研究结果一致。在水稻生长期间，其氮素来源于土壤现存氮素和外源氮素输入（人工施肥等）（尹冬，2011；朱杰等，2018）。而本研究在虾类养殖期间也未做施肥处理，水稻的氮素养分依靠有机氮矿化作用产生的铵态氮提供，因而至试验末期土壤全氮含量和铵态氮含量显著下降。

已有研究表明，底栖生物会影响土壤有机氮的降解。马红波（2001）研究发现，底栖生物通过影响沉积物环境而影响氮循环，加速沉积物矿化作用的进行，影响NH-N的生成速率；在Hulth等（2004）的研究结果中，底栖生物的生理活动会在沉积物中形成孔洞，使有氧界面在沉积物中延伸，进而影响有机氮的矿化；Hou等（2020）进一步研究发现，日本沼虾生物扰动可改变沉积物氧化还原电位，促进有机物的降解，加速有机氮的矿化。本研究室内矿化培养试验结果显示，2种模式下末期土壤累积氮矿化量、矿化势、可矿化氮比例均显著高于试验初期，且同一时期RC模式的累积氮矿化量、矿化势、可矿化氮比例也均显著高于RM模式，表明稻虾共作末期土壤有机氮矿化作用较前期有所增强，RC模式中土壤有机氮矿化作用强度大于RM模式。在本研究中，虾类作为稻田中最主要的底栖生物，除摄食投喂的饵料外，还会摄食植物残体、有机碎屑等，可加速土壤中有机质的降解（Ferris et al.，1998），其摄食行为也会对土壤造成一定的搅动，降低土壤团聚体大小，进一步增强有机氮的矿化作用（王根林等，2009）。同时，较罗氏沼虾而言，红螯螯虾自身还有掘穴行为，可连通表层和中层土壤，改善中层土壤的通气状况，其水气条件等能更好地满足好氧微生物生长（Kravchenko et al.，2017），因而更能提高有机氮的矿化作用。另外，底栖生物的摄食、爬行等生命活动也会对土壤微生物群落的结构、活性和多样性造成影响（Laverock et al.，2010；Rugenski et al.，2012；Delmont et al.，2014；宋宇等，2020）。稻虾共作期间，红螯螯虾、罗氏沼虾的不同生活习性为土壤微生物营造了不同的生存环境，使得末期2种模式间微生物群落结构和多样性产生明显区别。

除底栖生物外，土壤微生物群落的也是有机氮矿化作用的重要影响因子，微生物的种类、结构、功能与有机氮的分解、矿化密切相关（李辉信等，2004；张俊清等，2004）。本研究中，放线菌门、绿弯菌门、变形菌门均与矿化作用相关参数呈极显著正相关，而拟杆菌门、脱硫杆菌门、硝化螺旋菌门与矿化参数呈极显著负相关。前人研究表明，变形菌门是一种r策略细菌（富营养菌），能加速土壤有机质分解，在土壤氮素循环中发挥重要作用（徐凡迪等，2021）；放线菌门部分属类可参与碳、氮循环，降解木质素，加速土壤植物残体的分解，降低土壤木质素总量和氮总量的比值，促进有机氮的矿化（谢长校等，2015；Hua et al.，2021）；绿弯菌门部分属类以有机质为碳源，可加速有机质降解（Davis et al.，2011），对土壤有机氮的矿化有促进作用；拟杆菌门与土壤有机碳和氮素含量有较好关联性，可反映有机质的降解程度，高有机质水平时相对丰度较高（Fierer et al.，2012；赵雅姣等，2020）；而脱硫杆菌门部分属类可将有机质完全氧化成CO或部分氧化为乙酸盐，降低其余微生物的碳源利用能力，从而抑制有机氮的矿化；硝化螺旋菌门部分属类微生物为化能无机自养，通过亚硝酸盐氧化还原酶介导的亚硝酸盐氧化生成硝酸盐来获取能量，抑制土壤有机氮的矿化过程（Liang et al.，2021）。在试验末期，2种模式土壤中放线菌门、绿弯菌门、变形菌门相对丰度均上升，拟杆菌门、脱硫杆菌门、硝化螺旋菌门相对丰度均下降。由此可知，稻虾共作模式能提升利于有机氮矿化的微生物相对丰度，进而提高土壤有机氮矿化作用的强度。进一步对末期2种模式间以上菌门的相对丰度进行比较分析，结果显示RC模式放线菌门、绿弯菌门相对丰度显著高于RM模式，而脱硫杆菌门、硝化螺旋菌门显著高于RM模式。结合微生物相对丰度与矿化参数的相关分析结果可知，与有机氮矿化作用相关的微生物在不同模式中的相对丰度不同，是导致2种模式间有机氮矿化参数产生显著差异的直接原因。

4 结论

虾类的生活习性不同造就了不同的土壤环境，进而影响土壤微生物的群落结构组成，导致2种稻虾共作模式间耕层下部10~20 cm土层土壤有机氮的矿化作用产生差异。在江苏省靖江市，与稻—罗氏沼虾共作模式相比，稻—红鳌螯虾共作模式下的稻田土壤有机氮的矿化作用更强，矿化势等相关参数更高，具有较高的供氮潜力，更有利于水稻的生长。