梁万前，李建华，白彩艳，李燕，陈志刚

心肌炎是由心脏损伤引起的心肌组织炎症性疾病，其感染原因包括病毒、细菌、原生动物或真菌，常见的心肌炎由病毒感染引起[1,2]。病毒性心肌炎可表现为疲劳和呼吸短促的非特异性症状或类似急性冠状动脉（冠脉）综合征的侵略性症状，给其临床诊断、预后和治疗带来挑战[3]。因此，寻找特异反映病毒性心肌炎病理特征的分子生物标记物成为研究的重点。微小RNA（miRNA）在心脏发生、心脏病等多种生理病理过程中发挥重要作用[4]。近年来，研究发现广泛保守的miR-26家族与肥胖症、胆管癌和心血管疾病密切相关[5-7]，且在乙肝病毒感染的人外周血单核细胞中表达下降[8]，但尚未报道miR-26家族成员之一miR-26b在病毒性心肌炎病理进展中的功能。此外，在包括冠心病、心肌梗塞、动脉粥样硬化等多种心血管疾病中，可溶性生长刺激表达基因2蛋白（sST2）与心血管疾病的严重程度呈正相关，具有诊断和预后价值[9]，与病毒感染引起的炎症性疾病相关[10]，但sST2与病毒性心肌炎是否存在联系尚不明确。本研究拟观察病毒性心肌炎患者和健康体检者血清中miR-26和sST2表达水平，初步探究其与病毒性心肌炎患者病情的关系及预测预后的临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象与分组纳入2017年3月至2019年12月间于新乡医学院第一附属医院心内科收治的病毒性心肌炎患者56例，其中男性26例，女性30例，年龄23～65（44.32±9.11）岁。病毒性心肌炎患者的诊断标准符合《2013欧洲心脏病学会心肌炎的病因、诊断、管理和治疗共识》[11]。纳入标准：①符合诊断标准；②年龄18～65岁；③治疗前1～2月内均具有病毒感染史；④病史资料完整。排除标准：①患有肝、肺、肾或其他血液系统疾病；②患有高血压、感染性心内膜炎等心脏病；③非首次发病；④恶性肿瘤患者；⑤非自愿加入实验者。根据患者病情严重程度分：轻度17例，中度19例，重度20例。另选取上述期间健康体检者56例为正常对照，其中男性24例，女性32例，年龄21～65岁，平均年龄为（46.18±8.64）岁。本研究经过我院伦理委员会批准，研究对象及家属均知情同意并签字确认。

1.2 方法

1.2.1 样本采集分别采集病毒性心肌炎患者和健康体检者晨起空腹静脉血5 ml，-4℃置于生化管内，离心（2500 r/min，15 min）后，收集上清液，分装（避免多次冻融）标记，-50℃保存，待检。

1.2.2 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测血清中miR-26b表达水平根据Trizol试剂盒说明提取各组血清总RNA，反转录得cDNA。严格按照qRT-PCR试剂盒说明书步骤检测各组血清中miR-26b表达水平。qRT-PCR反应条件：95℃预热1 min，55℃反应1 min，72℃反应1 min，72℃延长5 min，共40个循环。反应结束后，收集数据，以U6为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算miR-26b相对表达量，其中miR-26b和U6引物序列由由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成，表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 酶联免疫吸附法检测sST2水平根据sST2试剂盒说明书步骤，以空白孔调零，在加入终止液15 min内，测量各组在450 nm波长处各孔OD值，检测各组样本中sST2表达水平。

1.2.4 主要仪器与试剂RNA提取试剂盒（编号：R0011）购自上海碧云天有限公司；sST2试剂盒（QY-H50015）购自齐一生物科技（上海）有限公司；TaqMan一步式qRT-PCR试剂盒（Probe qRT-PCR）（T2210）购自北京Solarbio公司；qRT-PCR仪和MODEL550型酶标仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2.5 观察指标比较患者治疗后3个月心电图、肌钙蛋白恢复情况及临床症状变化，分为预后良好组（临床症状消失或好转，心电图或肌钙蛋白恢复正常）和预后不良组（临床症状、肌钙蛋白和心电图均未显著改善甚至加重），比较两组血清miR-26b、sST2水平，及对预后的预测效果。

1.3 统计学分析所有数据均采用SPSS 20.0统计学软件分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，两组间均数的比较采用t检验，多组间均数的比较采用方差分析。计数资料采用例数（构成比）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验。利用ROC曲线评估血清中miR-26b、sST2水平对病毒性心肌炎预后不良的预测价值。利用多因素Logistic分析影响病毒性心肌炎患者预后不良的危险因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料病毒性心肌炎患者与健康体检者的年龄、男性比例、总胆固醇、三酰甘油和胆固醇酯含量差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，表2。

表2 一般资料比较

2.2 血清中miR-26b、sST2表达水平比较与健康体检者相比，病毒性心肌炎患者血清中miR-26b表达水平显著降低（P＜0.05），sST2水平显著升高（P＜0.05），差异均有统计学意义（P＜0.05），表3。

表3 miR-26b、sST2在病毒性心肌炎患者和健康体检者血清中表达水平比较

2.3 不同严重程度病毒性心肌炎患者miR-26b及sST2水平比较与轻度病毒性心肌炎患者相比，中度和重度患者血清中miR-26b表达水平均显著降低（P＜0.05），sST2表达水平显著升高（P＜0.05）；与中度患者相比，重度患者血清中miR-26b表达水平均显著降低（P＜0.05），sST2表达水平显著升高（P＜0.05），表4。

表4 miR-26b、sST2在不同严重程度病毒性心肌炎患者血清中表达水平比较

2.4 预后良好和预后不良病毒性心肌炎患者血清miR-26b、sST2水平比较与预后不良组相比，预后良好组病毒性心肌炎患者血清miR-26b水平显著升高（P＜0.05），sST2水平显著降低（P＜0.05），表5。

表5 预后良好和预后不良病毒性心肌炎患者血清miR-26b、sST2水平比较

2.5 血清中miR-26b、sST2水平对病毒性心肌炎预后不良的预测价值ROC曲线显示，血清miR-26b预测病毒性心肌炎患者预后不良的曲线下面积（AUC）为0.804（95%CI：0.653～0.954，P＜0.001），截断值为0.389，对应的敏感度为78.6%，特异性为83.3%；血清中sST2预测病毒性心肌炎患者预后不良的AUC为0.830（95%CI：0.691～0.969，P＜0.001），截断值为86.689 ng/ml，敏感度为78.6%，特异性为88.1%；两者联合预测病毒性心肌炎患者预后不良的AUC为0.888（95%CI：0.777～0.999，P＜0.001），敏感度为85.7%，特异性为73.8%。（图1）。

图1 血清中miR-26b、sST2水平对病毒性心肌炎预后不良的预测价值

2.6 影响病毒性心肌炎患者预后不良的危险因素以病毒性心肌炎患者预后情况为因变量，以血清miR-26b、sST2水平为自变量进行多因素Logistic分析，结果显示血清miR-26b水平低、sST2水平高是影响病毒性心肌炎患者预后不良的危险因素（P＜0.05），表6。

表6 影响病毒性心肌炎患者预后不良的危险因素分析

3 讨论

miRNA是非编码RNA家族的成员，通过影响mRNA稳定性并充当蛋白质翻译的负调节剂，调控许多信号传导途径和细胞过程[12]。在心血管系统中，miRNA控制心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞的功能，参与心肌梗塞、心力衰竭、炎症和动脉粥样硬化等疾病的病理生理学进展[13]。赵欣等[14]研究发现，miR-26a/b在慢性心房纤颤患者心房组织中表达水平显著下调。在血管钙化维持性血液透析患者血清中，miR-26a水平显著降低[15]。本研究发现，病毒性心肌炎患者与健康体检者的年龄、男性比例、总胆固醇、三酰甘油和胆固醇酯差异无统计学意义，具有可比性，但病毒性心肌炎患者血清中miR-26b表达水平显著降低，与赵欣、石现军等[14,15]研究类似，提示miR-26b低表达可能与病毒性心肌炎患者病情发展相关。sST2是与炎症和纤维化相关的生物标记物，在心力衰竭患者血清中，sST2表达水平高于健康体检者[16]。本研究结果显示，病毒性心肌炎患者血清中sST2水平显著高于健康体检者，与李祥东等[16]研究相似，提示血清中sST2高表达可能与病毒性心肌炎发展相关。侯丽娟等[10]研究发现，慢性乙型肝炎病毒感染患者比健康体检者血清中sST2水平高，并与患者病情严重程度相关。本研究结果显示，轻度、中度和重度病毒性心肌炎患者血清中miR-26b表达水平依次降低，sST2表达水平依次升高，提示miR-26b低表达、sST2高表达可能与病毒性心肌炎患者的严重程度相关。

miR-26能够通过调节炎症相关的细胞因子表达，参与和炎症相关疾病的发生发展，而其低表达与预后不良相关[17]。sST2作为一种新型生物标记物，对心力衰竭等心血管疾病的死亡率具有很强的独立预测价值[18]。在心脏骤停给予心肺复苏患者中，sST2高表达的死亡率高于低表达患者，可以作为预后评估的良好指标[19]。此外，sST2也可以预测冠状动脉搭桥术后死亡风险[20]。本研究结果显示，预后不良组病毒性心肌炎患者相对于预后良好组患者血清miR-26b水平显著降低，sST2水平显著升高，提示miR-26b低表达、sST2高表达可能与病毒性心肌炎患者预后不良相关。ROC结果显示，血清miR-26b、sST2预测病毒性心肌炎患者预后不良的AUC分别为0.804、0.830，二者联合预测的AUC为0.888，提示血清miR-26b、sST2对患者预后均有一定的预测价值，二者联合预测价值更高。进一步Logistic分析显示，血清中miR-26b水平低、sST2水平高是影响病毒性心肌炎患者预后不良的危险因素，再一次表明miR-26b低表达、sST2高表达与病毒性心肌炎患者的预后密切相关，推测miR-26b和sST2可能是用于预测病毒性心肌炎预后的潜在生物标志物。

综上所述，病毒性心肌炎患者血清中miR-26b低表达，sST2高表达，与病毒性心肌炎患者严重程度和不良预后相关，监测病毒性心肌炎患者血清中miR-26b和sST2表达水平可能对预测患者病情发展和改善预后具有重要临床意义，这可能有助于病毒性心肌炎的临床诊断和治疗。但病毒性心肌炎发病原理涉及复杂的生物学机制，且本研究样本量少，结局具有局限性，后续需加大样本量，进行更深入的研究。