曲守方 李丽莉 张文新 孙楠 黄传峰 黄杰

染色体微缺失/微重复综合征是一类常见的染色体病，由一段染色体的缺失或重复所造成。研究报道的染色体微缺失/微重复综合征达到300 多种，包括天使综合征（Angelman syndrome，AS）、普拉德⁃威利综合征（Prader⁃Willi syndrome，PWS）、猫叫综合征（Cri duChat syndrome）、迪格奥尔格综合征（DiGeorge syndrome，DGS）、史密斯⁃马吉利综合（Smith⁃Magenis syndrome）、威廉姆斯综合征（Williams⁃Beuren syndrome，WBS）、4 号染色体短臂末端亚端粒缺失综合征（Wolf⁃Hirschhorn syn⁃drome）等［1⁃3］。染色体微缺失/微重复综合征由于染色体缺失片段或者重复片段较为微小，通常被产前诊断漏检，导致新生儿出生缺陷，出现先天性心脏病、泌尿生殖系统发育异常、免疫缺陷、发育迟滞和认知障碍等各种临床表型［4⁃5］。产前筛查和产前诊断能够避免产生遗传缺陷患儿，从而减轻患儿的家庭负担，具有重要的临床意义。

染色体微缺失/微重复综合征的检测技术包括荧光原位杂交技术法（fluorescence in situ hybrid⁃ization，FISH）、荧光定量PCR（realtime fluores⁃cence quantitative PCR，RTFQ PCR）、多重链接探针法（multiplex ligation⁃dependent probe amplifica⁃tion，MLPA）、染色体微阵列分析（chromosomal mi⁃croarray，CMA）和高通量测序技术（high through⁃put sequencing technology）等。目前国内多家公司开发了基于高通量测序技术的染色体拷贝数变异检测试剂盒，用于检测染色体微缺失综合征。本研究评价基于高通量测序技术的染色体微缺失检测的准确性，为该类试剂盒的性能评价提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象

染色体拷贝数变异检测国家参考品，批号：360024⁃201801，中国食品药品检定研究院提供。其中染色体微缺失样本，包括DiGeorge 综合征、Prader⁃Willi/Angelman 综合征和Williams⁃Beuren 综合征。

1.2 主要试剂

染色体拷贝数变异检测试剂盒（可逆末端终止测序法）、高通量测序文库构建DNA 纯化试剂盒（磁珠法）和测序反应通用试剂盒（测序法），购自杭州贝瑞和康基因诊断技术有限公司；KAPA Library Quantification Kits 定量试剂盒，购自美国KAPA BIOSYSTEMS 公司。

染色体非整倍体和拷贝数变异检测试剂盒（联合探针锚定聚合测序法）和测序反应通用试剂盒（联合探针锚定聚合测序法），购自华大生物科技（武汉）有限公司；ExKubit dsDNA HS Assay Kit，购自依科赛生物科技（太仓）有限公司；QubitTMssDNA Assay Kit，购自美国INVITROGEN 公司。

染色体拷贝数变异检测试剂盒（半导体测序法）和测序反应通用试剂盒（半导体法），购自东莞博奥木华基因科技有限公司。

1.3 主要仪器

T100 Thermal Cycler 基因扩增仪，购自美国BIO⁃RAD 公司；QuantiStudio 3 实时荧光定量PCR仪，购自美国应用生物系统公司；NextSeq CN500基因测序仪，购自杭州贝瑞和康基因诊断技术有限公司。

ABI 9700 PCR 仪和Qubit 荧光定量仪4.0，购自美国应用生物系统公司；BGISEQ⁃500 基因测序仪，购自华大生物科技（武汉）有限公司。

ABI 9902 基因扩增仪和ABI7500 荧光定量PCR仪，购自美国应用生物系统公司；BioelectronSeq 4000基因测序仪，购自博奥木华基因科技有限公司。

1.4 方法

使用T100 Thermal Cycler 基因扩增仪进行染色体微缺失DNA 片段化、酶灭活、末端补平和接头连接等步骤，构建文库。使用高通量测序文库构建DNA 纯化试剂盒（磁珠法）进行文库纯化。纯化后的文库用QuantStudio 3 实时荧光定量PCR仪和KAPA Library Quantification Kits 进行浓度测定。按照等摩尔量混样规则进行检测文库混样。使用基因测序仪（NextSeq CN500）和测序反应通用试剂盒进行（测序法）测序。

使用ABI 9700 PCR 仪进行染色体微缺失DNA打断修复、接头连接和PCR 扩增等步骤，获得文库。使用ExKubit dsDNA HS Assay Kit 和Qubit 荧光定量仪4.0 对纯化的文库进行浓度测定。使用测序反应通用试剂盒（联合探针锚定聚合测序法）进行环化反应。使用QubitTMssDNA Assay Kit 和Qubit 荧光定量仪4.0 对DNA 纳米球（DNA nanoball，DNB）产物进行浓度测定，然后将DNB 产物加载到芯片。使用基因测序仪（BGISEQ⁃500）进行测序。

使用试剂盒的核酸内切酶将基因组DNA 随机打断；使用ABI9902 基因扩增仪进行接头连接和扩增富集后获得DNA 文库。使用ABI7500 荧光定量PCR 仪和试剂盒定量标准品对文库定量，然后进行文库混合。使用BioelectronSeq 4000 基因测序仪和测序反应通用试剂盒（半导体法）进行测序。

对样本DNA 进行低深度全基因组测序，采用试剂盒配套的染色体拷贝数变异检测软件对获得的测序数据进行数据分析。将各条染色体上不同窗口对应的拷贝率和全基因组范围内的检验统计值与正常样本的检验统计值比较找出变异区域，再根据变异区域的位置信息和长度判定样本拷贝数变异情况。

2 结果

对试剂盒范围内的国家参考品中染色体微缺失样本进行检测，不同测序仪平台的染色体拷贝数检测试剂盒的结果显示均检出标注的染色体拷贝数变异（Copy number variations，CNV），而且试剂结果和对照方法CNV 结果的交叠区域（overlap）均在对照方法的变异区域的80%～100%范围内，见表1。国家参考品中DiGeorge 综合征样本的结果显示不同试剂盒均能检测到22q11.2 区域缺失，试剂盒A 的拷贝数检测值（Sample Copy Number，SCN）是0.984，试剂盒B 的检测值（Copy Ratio）是0.524，试剂盒C 的拷贝数是1.06，见表1 和图1。国家参考品中Williams⁃Beuren 综合征样本的结果显示不同试剂盒均能检测到7q11.23 区域缺失并覆盖关键基因ELN 的位置（chr7：73442503⁃73484236），试剂盒A 的SCN 是1.040，试剂盒B 的Copy Ratio 是0.543，试剂盒C 的拷贝数是0.93。见表1 和图2。

表1 染色体微缺失准确性结果Table 1 Results of accuracy for chromosome microdeletion

图1 不同试剂盒DiGeorge 综合征样本的检测结果Figure 1 Results of DiGeorge syndrome by detection kits

图2 不同试剂盒Williams⁃Beuren 综合征样本的检测结果Figure 2 Results of Williams⁃Beuren syndrome by detection kits

3 讨论

由致病性基因组拷贝数变异导致的染色体微缺失/微重复综合征是胎儿出生缺陷的重要遗传学病因。研究报道多重链接探针法和染色体微阵列分析法等技术方法可以联合应用核型分析技术提高染色体异常的检出率［6⁃8］。传统核型分析虽然是染色体疾病诊断的金标准，但是具有操作复杂、对羊水细胞培养失败率高和无法检出5 Mb 以下的拷贝数变异的局限性。而高通量测序技术具有准确性高、测序通量大、灵敏度高和检测成本低等优势，已经在临床上广泛应用于染色体拷贝数变异检测［9⁃10］。

DiGeorge 综合征作为一种染色体22q11.2 微缺失综合征，是22q11.2 区域内3 Mb 基因缺失引起的高异质性临床综合征。Williams⁃Beuren 综合征是染色体7q11.23 区域内1.5～1.8 Mb 基因杂合缺失引起［11］，ELN基因是关键基因，位置在chr7：73442503⁃73484236，与重复序列区域没有重叠，该综合征的临床解读原则为检测到7q11.23 区域缺失并完全覆盖关键基因。普拉德⁃威利综合征是父源染色体15q11.2⁃q13 近着丝粒区域印记基因缺陷引起的神经发育性疾病［12］。天使综合征是母源染色体15q11.2⁃q13 染色体区域的UBE3A基因表达异常或功能缺陷引起的神经发育障碍性疾病。虽然国内外不同的研究报道了染色体微缺失/微重复综合征的重要基因和核心区域，但是这些区域并不一致。为了满足临床检测的需要，不同公司设计开发的试剂盒对染色体微缺失/微重复区域的准确性检测是非常必要的。影响检测准确性的因素主要包括以下几个方面：样本有效数据量，变异区域的大小以及变异区域的位置等。开发的试剂盒对染色体微缺失/微重复的检测原理均是低深度全基因组测序，测序深度约为0.3×。在有效数据量达到质控标准的条件下，变异区域越大，所包含的测序窗口越多，纳入统计的数据也越多，检测结果的准确性和灵敏度越高。低深度全基因组测序会导致部分基因组区域没有覆盖，而且覆盖的区域也会有所不同，导致片段的断裂点出现随机误差。另外如果变异区域处于端粒位置或高度重复区域，也会影响检测变异区域位置的准确性［13⁃14］。

中国食品药品检定研究院研制的染色体拷贝数变异检测国家参考品，包括Jacobsen 综合征、Cri duChat 综合征、DiGeorge 综合征、Prader⁃Willi/Angelman 综合征、Smith⁃Magenis 综合征、Wil⁃liams⁃Beuren 综合征和Wolf⁃Hirschhorn 综合征等染色体微缺失微重复综合征样本。本研究使用不同测序平台的染色体拷贝数变异检测试剂盒，包括可逆末端终止测序法、联合探针锚定聚合测序法和半导体测序法，对染色体拷贝数变异国家参考品［15］的染色体微缺失综合征样本进行检测，选取了三种试剂盒共同检测范围内的综合征样本进行准确性评价。研究结果表明三种试剂盒均能检出相应的染色体拷贝数变异的位置，而且试剂结果和对照方法结果的交叠区域均在对照方法的变异区域的80%～100%范围内，能够满足国家参考品准确性的要求，表明试剂盒的染色体微缺失检测的准确性较好。在评价染色体拷贝数变异检测试剂盒准确性的性能时，不仅要求试剂盒能够检测出样本的染色体拷贝数变异类型，而且检测的变异区域要准确，才能为临床检测的需要提供有力的技术支持。