吴景 李晓洁 何杰

胃癌是常见恶性肿瘤之一，其发生与遗传、环境、饮食、生物及免疫功能等因素相关。EB 病毒（Epstein⁃Barr virus，EBV）是一种人疱疹病毒，主要感染B 细胞、上皮细胞，也会感染T 细胞和NK 细胞。EBV 感染与许多肿瘤及非肿瘤性疾病关系密切，已证实与鼻咽癌、EBV 感染相关的淋巴瘤、淋巴组织增生性疾病以及胃癌有关。EBV 编码的小RNA（Epstein⁃Barr encoded RNAs，EBER）以高拷贝数存在于EBV 感染的细胞核中，Tokuna⁃ga M 等［1］在1993年提出应用原位杂交检测EBER证实胃癌EBV 感染。本文通过回顾性分析胃癌组织中EBER 的表达情况，探索其与胃癌临床病理特征的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

收集安徽省肿瘤医院2018年6月至2019年5月胃癌根治性手术切除样本127 例，均为10%中性福尔马林缓冲液固定，石蜡包埋。男性患者93 例，女性患者34 例，年龄范围31 至85 岁，中位年龄65岁，入选的患者术前均未进行放化疗等抗肿瘤治疗。

1.2 主要试剂

EBER 探针、原位杂交消化酶、蓝染检测试剂盒、红色复染液、各清洗缓冲液、脱蜡液、液体封盖膜、细胞处理液均购自美国罗氏公司。

1.3 方法

肿瘤组织石蜡包埋后3 μm 厚度切片，60℃恒温箱烤片2 h，Ventana BenchMark XT 全自动染色仪进行全自动原位杂交检测。检测过程：组织脱蜡后经热修复及酶消化，荧光素标记的探针与组织中特异的靶序列进行杂交，加入带生物素的二抗与链酶亲合素⁃碱性磷酸酶混合物结合，底物经显色后产生蓝色沉淀物。用已知阳性组织作为阳性外对照。根据2016年美国癌症联合委员会/国际抗癌联盟（American Joint Committe on Cancer/Union for International Cancer Control，AJCC/UICC）胃癌TNM分期标准（第八版）［2］对所有患者进行病理分期。

1.4 统计学方法

应用SPSS 22.0 软件进行统计分析。计数资料以n（%）表示，采用χ2检验及Fisher 精确检验法进行组间比较。P＜0.05 示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EBER 在胃癌组织中的表达

EBER 定位于细胞核，表现为蓝色信号，呈弥漫性或散在的点状染色，与红色衬染的背景形成鲜明对比。127 例胃癌中13 例EBER 阳性，阳性率10.2%。除表达于肿瘤组织区域，EBER 也可见于邻近肿瘤的异型增生组织中，间质往往伴有多量淋巴细胞浸润。见图1。

图1 EBER 在胃癌中的表达（×100）Figure 1 Expression of EBER in gastric cancer（×100）

2.2 EBER 与胃癌患者临床病理特征的相关性

不同的lauren 分型之间EBER 阳性率存在差异（χ2=6.290，P＜0.05），在混合性中感染率最高。不同性别、年龄、肿块部位、肿块直径、TNM 分期、淋巴结转移数之间的EBER 阳性率差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 EBER 与胃癌患者临床病理特征的相关性［n（%）］Table 1 Correlation between EBER and clinicopathological features in patients with gastric cancer［n（%）］

3 讨论

EBV 进入人体在历经急性期的细胞免疫应答之后，于记忆性B 细胞中终身潜伏。人体不同感染状态表达不同的抗原，主要有EBV 核心抗体、膜蛋白及小RNA。LMP⁃1 是其中一种潜伏期膜蛋白，临床上常用免疫组化法检测LMP⁃1 的表达，但LMP⁃1 多见于B 细胞感染的潜伏Ⅱ型，在胃癌细胞中较少表达或者不表达［3］。而EBER 是EBV 在潜伏期表达最多的病毒基因，通过探针与待测转录本结合，可特异性鉴别感染EBV 的细胞，阳性率高达95%，因此，作为EBV 检测的金标准。

研究报道EBV 相关性胃癌（EBV associated gastric carcinoma，EBVaGC）在胃癌中的比例为6%～12%［4⁃5］。多数研究显示，相对于EBV阴性胃癌（Epstein⁃Barr virus negative gastric carcinoma，EBVnGC），EBVaGC 患者具有独特的临床病理特征。 EBVaGC 患者更年轻，更常见于男性，原发性肿块较小，肠型胃癌较多见，好发于食管胃交界处以及残胃，并具有较低的临床分期和更好的整体生存率［4，6⁃7］。一项全球4599 例患者的荟萃分析显示，EBVaGC 患者的中位生存期为8.5年，EBVnGC仅有5.3年［4］。本研究并未发现EBV 感染在患者年龄、性别及肿块大小、肿块部位以及病理分期上显著的差异，可能与收集样本数目有关，扩大样本量以及样本种类，可能对结果更具有提示意义；大部分研究认为EBVaGC 淋巴结转移率低［8］，鉴于大于6 枚的淋巴结发生癌转移与胃癌临床预后关系密切，本文在此类型患者中仅发现1 人感染，与文献报道也相符合。同时本研究发现EBV 感染与lauren 分型有关，在感染的混合性胃癌病例中，EBV 多感染管状腺癌成分。并且，在富含淋巴细胞浸润、腺管分化较差的腺癌中也易见EBER 的表达，此类型胃癌称之为髓样癌，又叫胃淋巴上皮样癌，与EBV 感染极为密切［9⁃10］。研究报道，胃淋巴上皮样癌由于肿瘤突变负荷增加以及免疫调节分子诱导导致淋巴细胞在肿瘤间质大量富集［11］。这里需要提出的，在癌旁可观察到异型增生的腺管合并有EBV 感染，这是否与肿瘤发生后免疫功能损伤有关还未可知。

在肿瘤的发生机制上，国内外研究已证实EBV通过表达相关病毒基因逃避机体免疫应答，诱导细胞癌变，在胃癌发生早期发挥重要作用［8］。其根本的分子作用机制可能由于EBVaGC 中大量的基因启动子发生甲基化，如细胞周期调控基因、凋亡基因、DNA 修复基因、细胞黏附和迁移基因及信号转导基因等［12⁃13］。高通量测序发现EBVaGC 存在高频率的PIK3C 和ARID1A 基因突变［14］，也表明EBV 可能与肿瘤的发生和进展有关。并且EBVaGC 伴随存在的高扩增的PD⁃L1 可能导致肿瘤细胞的免疫逃逸［15］。

EBVaGC 是一种在流行病学，病因学，病理类型和分子机制上具有特异性的胃癌，临床上较少见，EBER 原位杂交有助于对该疾病的诊断，从而为临床EBVaGC 的筛查、诊断、治疗和预后判断提供可靠的病理学依据。