崔 婷，倪 红，刘 娟，彭 成，熊 亮*，刘 菲*

•化学成分 •

蓬莪术挥发油中倍半萜类化学成分及舒张子宫平滑肌活性

崔 婷1, 2，倪 红1, 2，刘 娟1, 2，彭 成1，熊 亮1, 2*，刘 菲1, 2*

1. 成都中医药大学药学院 西南特色中药资源国家重点实验室，四川 成都 611137 2. 成都中医药大学 西南特色药材创新药物成分研究所，四川 成都 611137

研究蓬莪术根茎挥发油中的化学成分及其舒张子宫平滑肌活性。采用硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱色谱、反相中压液相色谱、制备薄层色谱和半制备高效液相色谱等分离技术进行分离纯化，并运用多种现代波谱技术对化合物进行结构鉴定，通过NOE数据确定其相对构型，计算电子圆二色谱（ECD）确定其绝对构型。利用缩宫素致大鼠离体子宫平滑肌痉挛模型考察化合物对子宫平滑肌收缩活动的影响。从蓬莪术挥发油中分离得到2个倍半萜化合物，分别鉴定为(1,4,5,6,7,10)-1(10),4(5)-双环氧吉玛烷-11(12)-烯-6-醇（1）和curcumanolide A（2）。其中化合物2对缩宫素诱导的大鼠离体子宫平滑肌收缩具有抑制作用。化合物1为1个新的吉玛烷型倍半萜，命名为双环氧吉玛烯醇。化合物2具有舒张子宫平滑肌活性。

蓬莪术；挥发油；倍半萜；双环氧吉玛烯醇；curcumanolide A；生物活性；舒张大鼠子宫平滑肌

莪术为姜科植物蓬莪术Val.、广西莪术S. G. Lee et C. F. Liang或温郁金Y. H. Chen et C. Ling的干燥根茎[1]，主要分布于四川、广西、福建等地。最早记载于《药性论》：“能治女子血气心痛，破痃癖冷气，以酒醋磨服，效”[2]，具有行气破血、消积止痛之功效，治疗心腹疼痛，胁下胀疼等血凝气滞之证。作为活血化瘀的常用中药，莪术具有较好的调经止痛作用。早在《日华子本草》就有“莪术，通月经，消瘀血，止扑损痛，下血及内损恶血”。《济阴纲目》也有记载“莪术治经闭不通及血块疼痛”。在现代临床中，莪术也多用于治疗多种妇科疾病，如子宫内膜异位症[3]、卵巢癌[4]、痛经[5-6]等。现代研究发现莪术中活性成分主要为挥发油和姜黄素类，其中挥发油以倍半萜类为主[7-9]，具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、镇痛、抗血栓等作用[10-13]，但目前关于其治疗痛经的物质基础研究较为欠缺。课题组前期探索发现蓬莪术挥发油具有显著的舒张子宫平滑肌活性[14]，证实了蓬莪术挥发油与痛经等妇科疾病的相关性。因此，为了进一步研究蓬莪术挥发油舒张子宫平滑肌的物质基础，本研究应用多种色谱和波谱技术分离纯化和鉴定其中的倍半萜类成分，得到1个新的吉玛烷型倍半萜成分(1,4,5,6, 7,10)-1(10),4(5)-双环氧吉玛烷-11(12)-烯-6-醇（1）以及1个已知化合物curcumanolide A（2）；新化合物1命名为双环氧吉玛烯醇。对分离得到的化合物进行舒张子宫平滑肌活性研究，发现化合物2具有舒张子宫平滑肌活性，而化合物1无显著作用。

图1 化合物1和2的化学结构

1 仪器与材料

1.1 仪器与试剂

旋光测定仪（美国Rudolph公司）；Agilent Cary 600红外光谱仪（美国Agilent公司）；高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Bruker-600核磁共振波谱仪（德国Bruker公司）；Agilent 6230 LC/TOF高分辨质谱仪（美国Agilent公司）；圆二色谱仪（Applied Photophysics Ltd）；C18色谱柱（Welch公司，250 mm×10 mm，5 μm，半制备型）；Gradient Former B-687中压液相色谱仪（瑞士Buchi公司）；Milli-Q超纯水仪（美国Milli-pore公司）；旋转蒸发仪（上海贤德实验仪器有限公司）；SQP型电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；HSGF254高效薄层色谱硅胶板（烟台市芝罘黄务硅胶开发试验厂）；柱色谱硅胶、薄层色谱硅胶（青岛海浪硅胶干燥剂有限公司）；Sephadex LH-20葡聚糖凝胶（上海东曹生物科技有限公司）；反相C18填料（上海月旭科技股份有限公司）；Powerlab多功能生理记录仪、恒温水浴槽和Labchart Pro专业版软件［澳大利亚埃德仪器国际贸易（上海）有限公司］；DZKW-S-4型电热恒温水浴锅（国华电器有限公司）。

甲醇（色谱级，美国Sigma公司）；乙腈（色谱级，美国Fisher公司）；石油醚、二氯甲烷、二甲亚砜等分析纯试剂（成都市科隆化学品有限公司）；缩宫素注射液（江西省创欣药业集团有限公司，批号191011，规格2 mL∶10 U，使用时用生理盐水配成1 U/mL）；戊酸雌二醇片（DELPHARM Lille S.A.S.，批号498A，规格1 mg/片，使用时用纯水制备成0.8 mg/mL）；盐酸维拉帕米（中国食品药品检定研究院，批号100223-200102，规格50 mg/支，用纯水配成1×10−3mol/L的母液）。

1.2 动物

健康未孕成年SD大鼠，普通级，雌性，体质量220～250 g，由成都达硕实验动物有限公司提，动物生产许可证号SCXK (川) 2020-030。动物实验经成都中医药大学实验动物伦理委员会审核（备案编号为2020-04），均符合3R原则。

1.3 药材

蓬莪术药材采于四川省崇州市三江镇宋桥村，经成都中医药大学高继海副教授鉴定为姜科多年生草本植物蓬莪术Val.的干燥根茎，植物标本（CP-20200705）保存于成都中医药大学西南特色药材创新药物成分研究所。

2 提取与分离

蓬莪术药材（50 kg）粉碎后加10倍量水，通过水蒸气蒸馏法得到约420 g挥发油。将得到的挥发油通过分子蒸馏分为低沸点部位和高沸点部位。取高沸点部位（320 g）经硅胶柱色谱分离，以石油醚-醋酸乙酯（1∶0→0∶1）梯度洗脱，洗脱液经薄层色谱检测，合并相似组分，减压浓缩至稠浸膏，并依次编号为A～K。浸膏E经反相中压柱色谱，用甲醇-水（50%～100%）梯度洗脱，经薄层色谱法检视，合并相似洗脱馏分并减压浓缩，得15个馏分（Fr. E1～E15）。Fr. E8经硅胶柱色谱分离，以石油醚-丙酮（400∶1→1∶1）梯度洗脱，得到14份样品（Fr. E8-1～E8-14），其中Fr. E8-8经制备薄层色谱（石油醚-醋酸乙酯-丙酮10∶4∶3）分离成4份（Fr. E8-8-1～E8-8-4）。Fr. E8-8-3利用制备薄层色谱法（石油醚-醋酸乙酯-丙酮10∶7∶1）分离成3份（Fr. E8-8-3-1～E8-8-3-3），其中Fr. E8-8-3-2经反相半制备高效液相色谱分离，以70%乙腈-水为流动相进行洗脱（体积流量2.0 mL/min），得到3个馏分（Fr. E8-8-3-2-1～E8-8-3-2-3）。再将Fr. E8-8-3-2-1经反相半制备高效液相色谱分离，40%乙腈-水为流动相，1.5 mL/min进行洗脱，得到化合物1（1.72 mg，R＝23 min）。另取Fr. E5过硅胶柱色谱，以石油醚-醋酸乙酯-丙酮（400∶1∶1→3∶1∶1）梯度洗脱，得13个馏分（Fr. E5-1～E5-13）。其中Fr. E5-3经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱色谱分离，石油醚-二氯甲烷-甲醇（5∶5∶1）洗脱，得到4个馏份（Fr. E5-3-1～E5-3-4）。对Fr. E5-3-2进行反相半制备液相色谱分离，以48%甲醇-水为流动相进行洗脱，体积流量1.5 mL/min，分离得到化合物2（2.57 mg，R＝75 min）。

3 结构鉴定

为进一步确定化合物1的结构，进行了2D NMR实验（图2），化合物1的1H-1H COSY谱显示H-1/H-2/H-3相关、H-5/H-6相关、H-7/H-8/H-9相关。在HMBC谱中，H-2与C-1、C-3、C-4、C-10相关，H-3与C-2、C-4、C-5、C-15相关，H-6与C-5、C-7、C-8、C-11相关，H-8与C-7、C-9、C-10、C-11相关，H3-15与C-3、C-4、C-5相关，H3-14与C-1、C-9、C-10相关，OH-6与C-5、C-6、C-7相关。根据以上2D NMR数据推断化合物1为吉玛烷型倍半萜，且C-6位存在羟基取代，C-11/C-12位为双键，C-1/C-10和C-4/C-5位分别形成了三元氧环。

表1 化合物1的1H-NMR及13C-NMR数据(600/150MHz, acetone-d6)

Table 1 1H-NMR and 13C-NMR data for compound 1 (600/150MHz, acetone-d6)

碳位δHδC碳位δHδC 13.10 (1H, m)60.692.13 (1H, m), 0.98 (1H, m)40.9 22.25 (1H, m), 1.45 (1H, m)25.410—60.0 32.06 (1H, m), 1.17(1H, m)35.211—149.7 4—59.5124.86 (1H, brs), 4.74 (1H, brs)111.3 52.80 (1H, d, J = 8.4 Hz)68.8131.81 (3H, brs)22.1 63.49 (1H, ddd, J = 8.4, 4.8, 2.4 Hz)72.9141.31 (3H, s)17.0 72.12 (1H, m)50.9151.39 (3H, s)17.1 82.03 (1H, m), 1.02 (1H, m)22.76-OH4.02 (1H, d, J = 4.8 Hz)

图2 化合物1主要的1H-1H COSY、HMBC和NOE相关信号

化合物1的相对构型通过1D NOE差谱确定，照射H-1引起H-7、H-9 [H0.98 (1H, m)] 和H3-15增益，照射H-6引起H3-15增益，照射H-5引起OH-6和H3-14增益，证明H-5、OH-6、H3-14在同侧，H-1、H-6、H-7、H3-15在异侧。进一步通过计算ECD确定化合物1的绝对构型，使用IEFPCM模型，以乙腈为溶剂，在CAM-B3LYP/DGDZVP水平计算(1, 4, 5, 6, 7, 10)-1和(1, 4, 5, 6, 7, 10)-1的ECD谱，见图3。结果表明(1, 4, 5, 6, 7, 10)-1的理论ECD谱与化合物1的实验ECD谱吻合。因此，化合物1的绝对构型被确定为1, 4, 5, 6, 7, 10，化合物1被鉴定为(1,4,5,6,7,10)-1(10), 4(5)-双环氧吉玛烷-11(12)-烯-6-醇，经检索为新化合物，命名为双环氧吉玛烯醇。

图3 化合物1的实验ECD谱和计算ECD谱

化合物2：无色油状物。ESI-MS/: 257.151 5 [M＋Na]+，提示其分子组成为C15H22O2（计算值257.151 7，C15H22O2Na）。1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 4.95 (1H, brs, H-9a), 4.76 (1H, brs, H-9b), 2.82 (1H, dd,= 11.4, 8.4 Hz, H-1), 2.46 (2H, m, H2-6), 2.33 (1H, m, H-4), 2.24 (3H, brs, H3-12), 1.91 (1H, m, H-3a), 1.84 (3H, s, H3-13), 1.80 (1H, m, H-2a),1.73 (3H, s, H3-15), 1.64 (1H, m, H-2b), 1.18 (1H, m, H-3b), 0.87 (3H, d,= 7.2 Hz, H3-14)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 170.0 (C-8), 149.4 (C-10), 143.9 (C-11), 120.9 (C-7), 112.9 (C-9), 89.8 (C-5), 52.3 (C-1), 42.9 (C-4), 27.7 (C-6), 26.5 (C-2), 24.5 (C-12), 24.1 (C-13), 23.3 (C-3), 20.0 (C-15), 13.3 (C-14)。以上数据与文献报道基本一致[15]，故鉴定化合物2为 curcumanolide A。

4 大鼠离体子宫平滑肌舒张活性

4.1 溶液制备

取NaCl 9.2 g、KCl 0.42 g、CaCl20.24 g、NaHCO30.15 g、葡萄糖1.0 g，用生理盐水制备成1000 mL的溶液即得洛氏液。

4.2 大鼠离体子宫平滑肌肌条制备

采用课题组前期建立的模型及方法[16]，每天按8 mg/kg剂量ig戊酸雌二醇溶液，连续2 d，复制动情期大鼠模型。实验第3天，处死大鼠，将剖取下的子宫置于盛有洛氏液的玻璃皿中，轻轻剥离子宫上附有的结缔组织和脂肪组织，并取2～3 cm中间段子宫平滑肌。

4.3 蓬莪术挥发油成分对大鼠离体子宫平滑肌的舒张活性测试

将肌条一端固定于盛有20 mL洛氏液的恒温水浴槽中（浴槽中的洛氏液持续通入95% O2和5%的CO2，速度为1～2个小气泡/s），另一端连接张力换能器，记录子宫收缩曲线[17]。采用缩宫素（160 μL）复制子宫平滑肌收缩模型，并用PowerLab多功能生理记录仪记录子宫收缩曲线。以100 μL DMSO为溶剂对照组，终浓度0.5 μmol/L盐酸维拉帕米为阳性对照，给药组终浓度分别为2、10、50 μmol/L。观察10 min内离体子宫平滑肌的收缩张力，记录收缩曲线，并计算给药后的子宫平滑肌收缩张力抑制率，实验重复3～5次。采用统计学软件SPSS 19.0进行数据分析，结果以表示。

收缩张力抑制率＝(给药前收缩张力平均值－给药后收缩张力平均值)/给药前收缩张力平均值

结果（表2）表明，DMSO对子宫平滑肌收缩活动无明显影响。与对照组相比，阳性药组收缩张力明显降低（＜0.01），抑制率为（67.33±3.68）%；不同剂量的化合物2均可显著抑制子宫平滑肌收缩（＜0.01），且具有浓度相关性，其中50 μmol/L给药组效果最佳，抑制率达到（53.72±1.32）%。化合物1对子宫平滑肌收缩无显著影响。

表2 化合物2对缩宫素诱导的大鼠子宫平滑肌收缩活动的影响 (±s)

Table 2 Effects of compound 2 on oxytocin-induced rat uterine smooth muscle contraction (±s)

组别n/只浓度/(μmol∙L−1)收缩张力抑制率/% 对照5—10.01±1.15 盐酸维拉帕米5 0.567.33±3.68** 23 2 17.77±1.47** 31026.93±4.06** 35053.72±1.32**

与对照组比较：**＜0.01

**<0.01control group

5 讨论

蓬莪术为传统活血化瘀中药，具有行气破血、消积止痛的功效，可治疗血气心痛、胁下胀疼、血凝气滞、月经不调、经闭痛经、妊娠心腹痛等病症[18-20]。现代临床常用于心血管疾病和妇科疾病如痛经、月经不调等的治疗。基于蓬莪术的传统功效，课题组开展了一系列相关的物质基础研究，发现蓬莪术中部分倍半萜成分具有舒张血管和抗血小板聚集活性[21-22]。此外，还发现蓬莪术挥发油具有显著舒张子宫平滑肌作用[14]。因此，进一步对蓬莪术挥发油中活性倍半萜类化学成分进行了研究。

本研究采用现代分离手段和波谱学技术，从蓬莪术挥发油中分离鉴定了2个倍半萜，其中化合物1为新化合物，为1个具有双环氧结构的吉玛烷型倍半萜，并通过计算ECD确定了其绝对构型。进一步对分离得到的2个化合物进行舒张大鼠离体子宫平滑肌的活性筛选，发现化合物2能抑制子宫平滑肌收缩，抑制率随浓度的增加而升高，呈现剂量相关性关系（＜0.01）。本研究成果丰富了蓬莪术挥发油中倍半萜类成分，探索了蓬莪术挥发油倍半萜成分的舒张子宫平滑肌活性，为后续寻找更丰富的活性成分以及探索相关机制奠定了基础。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Sesquiterpenoids from volatile oil ofand relaxant effects on uterine smooth muscle

CUI Ting1, 2, NI Hong1, 2, LIU Juan1, 2, PENG Cheng1, XIONG Liang1, 2, LIU Fei1, 2

1. State Key Laboratory of Characteristic Chinese Medicine Resources in Southwest China, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. Institute of Innovative Medicine Ingredients of Southwest Specialty Medicinal Materials, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

To study the chemical components of the volatile oil ofrhizomes and their relaxant effects on uterine smooth muscle in rats.The chemical components were separated and purified by silica gel column chromatography, sephadex LH-20 column chromatography, reversed-phase medium pressure liquid chromatography, preparative thin-layer chromatography, and semi-preparative high performance liquid chromatography. The structures of the isolated compounds were identified by a variety of modern spectroscopic techniques. The relative configuration of the new compound was determined by NOE data analysis, then its absolute configuration was characterized by ECD calculations. In addition, an oxytocin-induced contraction model of rat uterine smooth musclewas used to evaluate the relaxant effects of the compounds on uterine smooth muscle.Two sesquiterpenoids were isolated from the volatile oil of, and their structures were determined as (1,4,5,6,7,10)-1(10),4(5)-diepoxygermacran-11(12)-en-6-ol (1) and curcumanolide A (2). Compound 2 showed an inhibitory effect against oxytocin-induced rat uterine smooth muscle contraction.Compound 1 is a new germacrane-type sesquiterpenoid and named biepoxygemarenol. Compound 2 has a relaxant effect on uterine smooth muscle.

Val.; volatile oil; sesquiterpenoids; biepoxygemarenol;curcumanolide A; biological activity;relaxant effects on rat uterine smooth muscle

R284.1

A

0253 - 2670(2022)14 - 4265 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.14.005

2022-05-07

国家自然科学基金青年基金资助项目（81903777）；国家自然科学基金青年基金资助项目（82104371）；国家自然科学基金优秀青年基金资助项目（82022072）

崔 婷（1999—），硕士研究生，从事中药药效物质基础研究。E-mail: 2584028137@qq.com

熊 亮（1983—），研究员，博士生导师，从事中药药效物质基础及开发应用研究。E-mail: xiling0505@126.com

刘 菲（1989—），副教授，从事中药药效物质基础研究。E-mail: feifeifly555@126.com

[责任编辑 王文倩]