庄明亮，李剑飞，王 志，牛庆生，陈东海，王进州，葛 蓬，李志勇，王 琦

(吉林省养蜂科学研究所，吉林 132108)

蛋白质是一切生命的物质基础，蜜蜂的生存需要蛋白质(薛嘉璐, 2020)，蛋白饲粮为蜜蜂的组织发育、修复等提供原料(庄明亮等, 2019)。正常条件下蜜蜂通过采集植物花粉来获得蛋白质营养，但在一些特殊环境，需要人工配制饲粮来满足蜜蜂的生长发育和生存，对于养蜂生产实践意义重大。蜂粮是成年蜜蜂的天然食粮，经由工蜂采集的植物花粉，加入花蜜和酶等，并贮存在巢房中发酵而成的产物(Claudia and Consuelo, 2016)。蜂粮的营养成分十分丰富，含蛋白质、碳水化合物、维生素和类黄酮等，对于蜜蜂蜂群的正常的生长发育至关重要(Wolfe and Dutton, 2015; 刘玥佳等, 2020)。近些年来，关于蜜蜂营养的研究取得了阶段性进展，集中在蜜蜂幼虫时期的蛋白质(李成成等, 2011; 刘俊峰等, 2011)、矿物质(张鸽和胥保华, 2012)、维生素(冯倩倩等, 2012; 廖春华等, 2016)等营养需要，缺乏对成年工蜂营养的系统研究。

本试验通过配制含有一定比例蜂粮和花粉的蛋白饲粮，在实验室纱笼条件下观察和记录蜜蜂的死亡情况，利用液相色谱/质谱联用技术(Liquid Chromatograph Mass Spectrometer, LC-MS)检测其对蜜蜂生理代谢的影响，通过分析计算筛选差异代谢物，并结合数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)，探讨对代谢通路的影响，发掘对蜜蜂寿命起关键作用的营养因素，为特殊环境中工蜂饲粮的合理配制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1供试蜜蜂

试验蜜蜂采自吉林省养蜂科学研究所的意大利蜜蜂Apismelliferaligustica蜂群。

1.1.2主要试剂

蜂粮(取自当年健康蜂群，现取现用)，蜂蜜(当年7月蜂场自取波美度42°成熟椴树蜜，保存于干燥通风环境)，杂花粉(取自当年健康蜂群)，蔗糖(广西大新湘桂制糖有限公司)，甲醇、甲酸、乙腈等(天津市彪仕奇科技有限公司)，L-2-氯苯丙氨酸(生工生物工程股份有限公司)。

1.1.3主要仪器

样品快速研磨仪(JXFSTPRP-24/32型，购自上海净信有限公司)，电子天平(JD300-3-G型，沈阳龙腾电子有限公司)，超声波清洗机(SB-5200DT型，宁波东鑫有限公司)，冷冻离心机(TGL-16MS型，上海卢湘仪器有限公司)，液相色谱仪(Nexera UPLC型，日本岛津公司)，高分辨质谱仪(QE型，赛默飞公司)。

1.2 试验方法

1.2.11日龄工蜂的获取

准备产过1～2代蜜蜂的空巢脾，利用蜂群清理，然后将巢脾置于底箱中央，并使用控产器限制蜂王产卵12 h，把此巢脾放入蜂群继箱中，工蜂出房前1 d提取巢脾，放到34.5℃ ± 0.3℃培养箱里，待工蜂出房。

1.2.2饲粮的配制

依据本团队前期工作基础(庄明亮等, 2021)，以蜂蜜、蔗糖粉、花粉和蜂粮为原料，按照一定比例配置3种饲粮。对照组饲粮：蜂蜜和蔗糖粉按照1 ∶3比例充分揉搓，装入铁纱笼5 g备用；试验组A饲粮：花粉、蜂蜜、蔗糖粉按照5 ∶1 ∶6比例充分揉搓，装入铁纱笼5 g备用；试验组B饲粮：蜂粮、蜂蜜、蔗糖粉按照5 ∶1 ∶6比例充分揉搓，装入铁纱笼5 g备用。铁纱笼为长方体结构(长×宽×高=13 cm×3.5 cm×3 cm)。

1.2.3蜜蜂死亡情况的观察记录

每组铁纱笼内装入30头1日龄的工蜂，放在避光安静的室内常温环境(25℃～29℃)饲养。每天固定时间观察和记录蜜蜂的死亡情况，并把死蜂清除。每组样品做3组平行处理。

1.2.4代谢组分析测定

根据上一步关于蜜蜂死亡情况观察的试验结果，针对试验组A和试验组B进行代谢组分析。室内饲养第5天，取生命体征正常的工蜂，2头成年工蜂装入1个2 mL离心管中，置于液氮中1.5 h后放入-80℃冰箱冷冻保存，每组6个生物学重复。

把蜜蜂样本放入研磨机70 Hz运行1.5 min，称取30 mg，加入20 μL L-2-氯苯丙氨酸、20 μL Lyso PC20和400 μL 甲醇，震荡40 s；冰水中超声提取15 min；-18℃静置25 min；4℃条件13 000 rpm离心10 min，取300 μL上清液浓缩挥干，加入400 μL甲醇 ∶水(1 ∶4)重新溶解，震荡40 s；4℃条件13 000 rpm再次离心10 min，用移液器吸取150 μL上清液，使用0.22 μL相针孔过滤，进行LC-MS检测。

色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C-18色谱柱，流动速度0.35 mL/min，柱温45℃；流动相A 0.1%甲酸，B甲醇，洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Mobile phase gradient elution

质谱条件：采用ESI离子源，电压正离子3 500 V负离子3 100 V，辅助气体流动速度为10 arb，鞘气体流动速度为35 arb，毛细管温度320℃。

1.2.5统计学分析

蜜蜂存活试验数据用SPSS 18.0进行分析，t检验进行差异显著性分析，P<0.05表示差异显著。代谢组数据用Progenesis QI v2.3软件(Nonlinear Dynamics Newcastle, UK)分析，用变量投影重要度(Variable Importance in the Projection, VIP)和t检验来分析差异代谢物。使用KEGG、The Human Metabolome Database(the human metabolome database, HMDB)数据库并结合文献进行定性分析。

2 结果与分析

2.1 饲喂不同蛋白饲粮的蜜蜂死亡情况

蜜蜂7 d内的死亡情况(表2)：各试验组工蜂在第1天和第2天均没有出现死亡；试验组A在第3天出现死亡，在第6天30头工蜂全部死亡；对照组和试验组B前5天均没有出现死亡，在第6天和第7天试验组B死亡数量均显著低于对照组(P<0.05)。7 d内每组总死亡情况：对照组死亡7.27 ± 1.78头，试验组A死亡30.00头，试验组B死亡2.34 ± 0.58头。前7天试验组B总死亡数量显著对于对照组和试验组A(P<0.05)。

表2 饲喂不同蛋白饲粮的蜜蜂死亡情况Table 2 Mortality of honeybees fed different diets

2.2 蜜蜂代谢物主成分分析

利用LC-MS方法分析饲喂不同蛋白饲粮工蜂的代谢物，色谱图的峰没有漂移，而且具有稳定的保留时间。经过t检验，设置VIP>1.0，FC>2.0，共筛选差异代谢产物393个，196个上调，197个下调(图1)。

图1 试验组A与试验组B差异代谢物的火山图Fig.1 Volcano plot of differentially expressed metabolites of two groups

蜜蜂代谢物主成分分析得分图PCA见图2-A，采用PCA方法来观测两试验组的分布趋势，试验样本全部在95%置信区间，两组可以明显区分开。

蜜蜂代谢物偏最小二乘法判别分析得分图PLS-DA见图2-B，在PCA模型的基础上进一步探讨加入蜂粮的饲粮与加入花粉的饲粮对蜜蜂代谢的差异，找到差异代谢物，建立PLS-DA模型，放大它们的差异。使用交叉验证法验证PLS-DA模型，模型预测率(Q2)均大于0.50，模型稳定可靠，且具有较好的分析判别能力。

图2 试验组A与试验组B蜜蜂代谢物PCA和PLS-DA得分图Fig.2 PLS-DA and PCA score scatter plots of bees metabolites in two groups注：A，三角形代表试验组；B，正方形代表试验组。图3同。Note: A, Triangle represents test group; B, Square represents test group. The same for Fig.3.

蜜蜂代谢物正交偏最小二乘法判别分析得分图OPLS-DA见图3-A，OPLS-DA可筛除与分类无关的噪音，优化重要变量，有利于识别差异代谢物。前3个有效主成分的R2X(cum)=0.528，R2Y(cum)=0.927，Q2(cum)=0.817，表明模型质量较好。

模型的排序验证图见图3-B，为了判别是否过拟合，采用200次响应排序检验(response permutation testing, RPT)和7次循环交互验证(7-fold cross validation)来检测模型的质量。Q2均在R2之下，并且Q2小于0，表明模型没有过拟合，稳定可靠，可以进行下一步差异代谢物的鉴定与分析。

2.3 差异代谢物鉴定与分析

2.3.1差异代谢物鉴定

试验组A与试验组B的差异代谢物情况，通过OPLS-DA分析后，在OPLS-DA模型中选择VIP值最大的前100个变量(VIP值大于2.0)，对这100个变量进行内标和积分校正。在Human、KEGG等数据库比对，共指认出15个差异代谢物，包括氨基酸、维生素、糖类等，试验组A相对于试验组B，上调的有4种代谢产物,下调的有11种代谢产物(表3)。

表3 试验组A与试验组B的差异代谢物Table 3 Identification of significantly different metabolites in two groups

2.3.2差异代谢物通路分析

利用KEGG数据库对差异代谢物进行通路分析(图4)。代谢通路差异显著的有甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路(Glycine, serine and threonine metabolism)、精氨酸和脯氨酸代谢通路(Arginine and proline metabolism)、赖氨酸降解通路(Lysine degradation)、戊糖磷酸通路(Pentose phosphate pathway)。

图4 差异代谢物KEGG代谢通路富集图Fig.4 Differential metabolite KEGG enriclument map注：蓝色虚线示意P值为0.05，条柱高于蓝线时，代表的通路具有显著性差异。Note: The value of P indicated by the blue dotted line was 0.05. When the column was higher than the blue line, the pathway represented by the blue dotted line had significant difference.Glycine, serine and threonine metabolism: 甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路; Arginine and proline metabolism: 精氨酸和脯氨酸代谢通路; Lysine degradation: 赖氨酸降解通路; Pentose phosphate pathway: 戊糖磷酸通路; Butanoate metabolism: 丁酸代谢通路; Alpha-Linolenic acid metabolism: α-亚麻酸代谢通路; Tyrosine metabolism: 络氨酸代谢通路; Tryptophan metabolism: 色氨酸代谢通路; Sphingolipid metabolism: 鞘脂代谢通路; ABC transporters: ABC转运蛋白代谢通路。

3 结论与讨论

优质的蜜蜂种质资源越来越引起人们的重视，其中邮寄蜂王是目前引入优良蜂种的最为常用方式。长途邮寄蜂王时，会伴有几头幼年陪嫁工蜂，再装入炼糖饲粮保证邮寄途中蜂王的安全。前期研究发现加入一定比例的蜂粮饲粮，工蜂不仅存活时间长而且又能保证王浆腺的正常发育，邮寄蜂王的存活率高(庄明亮等, 2021)。但加入相同比例花粉的饲粮，工蜂在纱笼这种特殊环境中却不能长时间存活，存活时间显著低于蜂粮饲粮组。本试验在纱笼条件下模拟特殊环境，通过液相色谱-质谱联用技术代谢组学研究饲喂相同比例蜂粮和花粉饲粮的工蜂的代谢差异物，找到影响工蜂寿命的关键因子。

本试验配置相同比例的花粉和蜂粮的A、B两组人工饲粮，与蜂蜜和蔗糖的炼糖饲粮对比。结果最先出现蜜蜂死亡是A组，出现在纱笼饲养的第3天，而且在第5天A组蜜蜂全部死亡。而且延长纱笼饲养时间发现，B组蜜蜂不仅存活时间长而且蜜蜂生命体征更活跃，说明B组的人工饲粮更加适合蜜蜂，能够保证蜜蜂在无法排泄的纱笼环境正常存活。蜜蜂接受不同蛋白饲粮的饲喂，它的寿命和活跃状况均不同。用镊子拉出A、B两组死亡蜜蜂的中肠，发现A组蜜蜂中肠膨大并且有许多花粉粒，在密闭的纱笼环境中无法消化吸收花粉，可能是A组蜜蜂短时间大量死亡的原因。本试验采用代谢组学方法来评定试验组A和B饲粮对蜜蜂生理代谢的影响，通过分析判断验证并指认出15个差异代谢物，包括氨基酸、维生素、糖类等。

本研究发现，试验组A和B鉴定出6种氨基酸及其衍生物差异显著，其中4种氨基酸含量降低，2种氨基酸含量提高。试验组A赖氨酸含量比试验组B下降，通过参考数据库KEGG，进一步对代谢通路分析发现赖氨酸降解通路出现差异。赖氨酸是蜜蜂生命活动的必需氨基酸，赖氨酸分解后容易生成乙酰-CoA，调控脂肪酸，为脂质产生提供物质基础(Narkewiczetal., 2000)。试验组A亮氨酸含量比试验组B下降，亮氨酸是蜜蜂体内重要的氨基酸，能够提高机体对蛋白质的利用效率，戴荣国等(2016)研究表明亮氨酸能够显著提高蜂群群势和封盖数量等。试验组A比试验组B相比氨基酸含量下降数量大于上升数量，氨基酸代谢与蜜蜂生存发育、调节抗逆性等活动极其相关。添加花粉的试验组A比添加蜂粮的试验组B维生素中检测出差异只有维生素B4，其在动物体内与许多中间物质的合成有关，如ATP等。添加花粉的试验组A比添加蜂粮的试验组B的肌苷含量下降。肌苷参与生物体内ATP、辅酶A等的合成，与生物体的能量及物质代谢相关。闫俊书等(2016)研究发现肌苷能促进三黄肉鸡体内ATP与蛋白质的合成，提高多种酶的活性，促进机体产生抗体。肌苷在蜜蜂机体内的应用研究还未见报道。

在室内纱笼等特殊环境中，工蜂饲粮不可直接加入花粉，可以按照6 ∶5 ∶1蔗糖、蜂粮、蜂蜜比例混合制成的人工饲粮，不仅可以提高蜜蜂存活率而且可以增加存活时间。采用LC-MS方法检测饲喂试验组A和B饲粮5日的工蜂，共筛选鉴定15种差异代谢物，主要包括赖磺酸、亮氨酸、维生素B4、肌苷等，主要涉及赖氨酸降解通路、精氨酸和脯氨酸代谢通路、能量代谢等途径。本试验结果可为蜜蜂饲养管理中人工饲粮配置提供一定理论基础。