于博驰，张克诚，施李鸣, 杨淼泠，吕朝阳，葛蓓孛

（中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193）

武夷菌素是从不吸水链霉菌武夷变种StreptomycesalbulusCK-15代谢产物中分离得到的一种广谱、高效和低毒的农用抗生素[1]，对蔬菜、果树等多种作物真菌病害防治效果明显，可有效防治黄瓜白粉病、番茄叶霉病等真菌病害，同时对作物生长还有一定的促进作用[2]，并以其良好的防治效果在农业上得到了广泛的应用，创造了良好的社会和经济效益[3]。武夷菌素毒性测定结果表明其毒性分级为低毒类，对人、畜低毒，对环境生物安全。孙延忠对武夷菌素的作用机制进行了研究，结果表明它可以改变菌丝体细胞膜的透性和抑制菌丝蛋白质的合成，破坏菌丝体细胞结构，造成菌丝原生质渗漏，致使菌丝畸形生长，从而降低病原菌的致病力，同时能够诱导植株对病原菌产生抗性，从而达到防治病害的效果[4]。

微生物源农药按成分可分为活体[5]和代谢产物[6]两类。代谢产物类农药包括中生菌素[7]、井冈霉素[8]、阿维菌素[9]等，活体微生物农药主要包括金龟子绿僵菌Metarhiziumanisopliae[10]、球孢白僵菌Beauveria bassiana[11]、绿色木霉Trichodermaviride[12]、哈茨木霉Trichodermaharzianum[13]和淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus[14]等。在实际使用过程中，由于在植物的不同生长时期，或者同一时期发生的不同病害必然导致在同一株植株上使用不同的微生物农药，那么这些代谢产物类农药与活体微生物农药之间的相互影响目前还没见相关的报道，值得进一步研究讨论。

本研究以牛津杯抑菌测试法[15]探究武夷菌素对球孢白僵菌，金龟子绿僵菌的影响，以菌丝生长抑制法[16]探究武夷菌素对绿色木霉、哈茨木霉、淡紫拟青霉菌丝生长率的影响，本研究对指导武夷菌素及活体微生物农药的田间用药，为生物防治技术集成提供理论基础，具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

淡紫拟青霉Paecilomyceslilacinus（Thorn.）Samson：山东绿陇生物技术有限公司提供；绿色木霉Trichodermaviride：微元生物有限公司提供；金龟子绿僵菌Metarhiziumanisopliae2-2和球孢白僵菌Beauveriabassiana105：中国农业科学院植物保护研究所草地植保实验室提供；哈茨木霉Trichoderma harzianum：中国农业科学院植物保护研究所生物防治研究室提供。

1.2 供试试剂和培养基

高保真KOD-plus DNA聚合酶购自日本TOYOBO公司；真菌DNA提取缓冲液：量取5 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0），2 mL 5 mol/L氯化钠，0.4 mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），5 mL 20% SDS，加ddH2O定容到 50 mL混匀；武夷菌素发酵液：中国农业科学院植物保护研究所农用抗生素组保存并提供。PDA培养基：马铃薯（煮汁）200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g；武夷菌素发酵培养基：玉米粉30 g，黄豆粉20 g，葡萄糖20 g，氯化铵4 g，碳酸钙3 g。

1.3 试验仪器

Tanon-1600型凝胶成像仪，购自上海天能科技有限公司；Sigma 1-14型离心机，购自德国Sigma公司；RS-232型摇床，购自上海智城分析仪器制造有限公司；DYY-6C型电泳仪，购自北京市六一仪器厂；Sigma 1-14型离心机，购自德国Sigma公司；DW-86W100型超低温冰箱，购自青岛海尔特种电器有限公司；牛津杯内径（6.0±0.1）mm，外径（7.8±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm；索尼数码相机，型号Sony DSC-T1。

1.4 武夷菌素对真菌孢子类的抑制

1.4.1 武夷菌素发酵液的制备 真菌悬浮液的制备：将真菌在PDAY培养基上进行平板划线，28 ℃培养72 h，用蒸馏水4 mL将孢子洗下来，4 ℃冰箱保存备用。武夷菌素的制备：将接种的武夷菌素发酵培养基放置于28 ℃恒温箱中培养64 h，滤纸过滤，再浓缩5倍，进行高效液相色谱效价测定，为20275 mg/L。

1.4.2 抑菌试验步骤 待制备好的PDA培养基冷却至40 ℃左右，往锥形瓶中加入保存好的菌液100 μL，摇匀；倒平板，每板倒入15 mL培养基；将武夷菌素用蒸馏水稀释至2000 mg/L，1500 mg/L，1000 mg/L，500 mg/L备用；用镊子将无菌的牛津杯轻轻放入培养皿中，吸取250 μL不同浓度武夷菌素加至牛津杯中，每组3个重复，放置28 ℃恒温培养，注意操作过程中不要将菌悬液溢出牛津杯外。待平板中开始形成清晰抑菌圈时进行测量，用十字测量法通过DIGITAL CALIPER电子数量游标卡尺进行测量，每组3个重复，每个平板抑菌圈用十字交叉法进行测量，最终取6个数据的平均值，记录试验数据。

1.4.3 测量最小抑菌浓度 在500～2000 mg/L抑菌圈的测量数据上，再次以不同武夷菌素浓度处理，找到生防菌的最小抑菌浓度（MIC），即能产生透明抑菌圈的最小抑菌剂浓度定为MIC，其判定标准为：在该浓度下抑菌圈直径大于或等于牛津杯直径[17]。

1.5 武夷菌素对真菌菌丝生长率的抑制

1.5.1 菌丝生长速率法测试步骤 在工作台无菌条件下用过滤薄膜过滤武夷菌素20 mL于离心管中待用。将100 mL规格PDA培养基放置微波炉加热，待冷至40 ℃时加入已除菌的武夷菌素分别为1.25 mL（25 mg/L），2.5 mL（50 mg/L），3.5 mL（75 mg/L）和5 mL（100 mg/L），将已加入除菌武夷菌素的PDA培养基混合均匀，倒板，每个平板15 mL，静置冷却，每组安排3个重复；在培养72 h后的金龟子绿僵菌、球孢白僵菌、淡紫拟青霉菌落的相同直径上用打孔器打菌饼并接到已冷却的含药培养基中心，在28 ℃恒温箱中静置培养。在真菌的生长过程中总共测3次，待对照组培养基中真菌长满整个培养基平板时为最后一次，用十字交叉法测量菌落直径，取平均值并计算抑菌率。抑制率＝（对照组菌落直径―试验组菌落直径）/对照组菌落直径

1.5.2 测量最小抑菌浓度 在25～100 mg/L菌丝生长速率法的测量数据上，再次细分不同的武夷菌素浓度，找到3种生防真菌的最小抑菌浓度。

2 结果与分析

2.1 武夷菌素对真菌孢子的抑菌结果分析

武夷菌素对生防菌细菌和真菌孢子的抑制试验结果显示：武夷菌素在高浓度处理下（500～2000 mg/L）对球孢白僵菌的抑制作用显著大于金龟子绿僵菌在低浓度武夷菌素处理下。武夷菌素对生防菌真菌孢子的最小抑制浓度测定结果显示：球孢白僵菌的最小抑菌浓度为400 mg/L，金龟子绿僵菌的最小抑菌浓度为200 mg/L，这可能是由于受到金龟子绿僵菌抑菌圈边界不够清晰的问题的影响（表1）。

表1 抑菌圈法测定不同浓度梯度武夷菌素对球孢白僵菌和金龟子绿僵菌的抑菌效果Table 1 Bacteriostatic zone method to determine the antibacterial effect of different concentration gradient Wuyiencin on B.bassiana and M.anisopliae.

在实际应用中，金龟子绿僵菌防治范围广，可防治8目30科200余种害虫。主要用于防治金龟子、象甲、金针虫、蛾蝶幼虫、蝽和蚜虫等害虫。球孢白僵菌主要用于防治松毛虫、玉米螟、蛴螬、蝗虫、茶小绿叶蝉、蚜虫、飞虱等害虫，采用喷粉的施用方式；武夷菌素用于防治多种作物上的白粉病、叶霉病、流胶病、病毒病、疮痂病，采用直接药液喷雾形式；存在与金龟子绿僵菌和球孢白僵菌同时使用的情况，可能影响田间防效，建议应错开使用。

2.2 武夷菌素对真菌菌丝生长率的抑制结果分析

武夷菌素100 mg/L浓度对三种真菌的抑制率分别为64.6%、48.6%和39.2%，抑制率由高到低分别为绿色木霉，哈茨木霉，淡紫拟青霉。而武夷菌素对绿色木霉、哈茨木霉、淡紫拟青霉最低抑制浓度测试表明，即使是极低浓度武夷菌素（6.25 mg/L）同样对绿色木霉、哈茨木霉、淡紫拟青霉存在抑制，抑制率分别为4.3%、4.1%和6.3%。因此实际生产应用中应避免武夷菌素与绿色木霉、哈茨木霉、淡紫拟青霉同时使用，以免影响药效（图1～4）。

图1 武夷菌素对三种真菌的抑制率Fig.1 Inhibition rate of wuyiencin on three fungi

图2 武夷菌素处理绿色木霉菌丝体抑制效果图Fig.2 The inhibitory effect of wuyiencin on T.viride

图3 武夷菌素处理哈茨木霉菌丝体抑制效果图Fig.3 The inhibitory effect of wuyiencin on T.harzianum

图4 武夷菌素处理淡紫拟青霉菌丝体抑制效果图Fig.4 The inhibitory effect of wuyiencin on P.lilacinus

对抑制率进行数据分析，得到武夷菌素对绿色木霉，哈茨木霉，淡紫拟青霉的毒力回归方程及 EC50值，结果表明武夷菌素对绿色木霉的EC50为57.13 mg/L，哈茨木霉的EC50为109.81 mg/L，淡紫拟青霉的EC50为170.03 mg/L（表2）。

表2 武夷菌素对三种真菌的毒力回归方程及EC50Table 2 The virulence regression equation and EC50 of wuyiencin to three fungi

淡紫拟青霉主要用于防治田间和温室内蔬菜、果树、花卉等农作物的白粉病、灰霉病、霜霉病、叶霉病、叶斑病等叶部真菌性病害，采用药液喷雾的形式[18]。而武夷菌素主要用于防治多种作物上的白粉病、叶霉病、流胶病、病毒病、疮痂病，同样是采用直接药液喷雾形式。两种农药同时使用，可能影响淡紫拟青霉的防效，建议应错开使用。

在田间实际应用中绿色木霉[19]和哈茨木霉都主要是采用拌种或与肥料混合施用于土壤，分别用于防治土传性病害和各种线虫病害。与武夷菌素的使用几乎不存在重叠，不需要考虑相互影响效果。

3 讨论

在球孢白僵菌和金龟子绿僵菌的抑菌试验中发现随着试验进行，同时抑菌圈的直径也在发生变化，试验数据采取的是抑菌圈的最大直径。从球孢白僵菌不同时期的抑菌圈图片可以明显看出抑菌圈的直径是随着时间的增长逐渐变小，在2000 mg/L高浓度处理下，即使在72 h仍保持一个较小的边界清晰的抑菌圈，而在1000 mg/L低浓度的处理下，随着时间的延长，72 h抑菌圈逐渐变得不明显。推测分析造成试验结果的原因有两点：一是由于随着时间增长，真菌孢子的生长及新陈代谢消耗了培养基中部分的武夷菌素，从而导致抑菌圈减小；二是由于真菌孢子在武夷菌素的处理下自身产生了耐性或者是抗性从而导致抑菌圈减小甚至消失。

根据不同浓度武夷菌素处理的绿色木霉、哈茨木霉、淡紫拟青霉的平板照片，发现随着武夷菌素处理浓度升高，菌丝体呈现出增厚的现象，以适应武夷菌素的抑制。而根据试验获得的绿僵菌平板照片可以看出抑菌圈边界模糊不确定，推测绿僵菌对武夷菌素产生一定的抗性，有部分孢子可在武夷菌素条件下生长繁殖。

本试验仅在离体条件下测得武夷菌素对活体微生物的抑制率，根据最小抑菌浓度得出初步结论。在时间和试验条件允许的情况下，应进一步安排田间试验进行验证。