猪TRIM21基因克隆与序列分析

2022-07-06宋慧欣李舒柔吴文琪陈子晴张嘉家覃丽梅赵孟孟

现代牧业 2022年2期

宋慧欣,李舒柔,杨柳,吴文琪,陈子晴,张航,张嘉家,覃丽梅,赵孟孟

(佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东佛山 528231)

先天免疫是动物在长期种系发育和进化过程中不断与病原微生物斗争逐渐形成的一系列机体防御机制，是机体非特异性地抵抗外来病原微生物感染的第一道防线。先天免疫模式识别受体(Pattern recognition receptors，PRRs)可识别一种或多种病原相关分子模式[1]，诱导白细胞介素、肿瘤坏死因子、干扰素(Interferon，IFN)等免疫相关因子的生成，从而调节先天免疫。PRRs信号通路易被激活或调节，在先天免疫系统和获得性免疫系统中都具有重要作用[2]。I型干扰素(IFN-I)是先天免疫系统早期对抗病毒感染的重要细胞因子，IFN诱导基因(IFN stimulated genes，ISGs)被IFN-I激活后表达，能增强机体的抗病毒能力。干扰素调控分子3(IFN regulatory factor 3，IRF3)是IFN-I通路的关键信号分子之一，宿主和病毒均可通过对IRF3蛋白功能的调控有效拮抗或促进IFN-I的产生[3]。

三联基序(Tripartite motif，TRIM)是一组高度保守的E3泛素连接酶蛋白，参与调控多种疾病的发生，其功能失调可导致癌症、免疫疾病或发育障碍等[4]。TRIM蛋白家族N端都具有3个保守结构域RING、B-Box和Coiled-coil(即RBCC结构域)[5,6]，其中RING结构域在泛素化调控中发挥重要作用。根据其多变的C端结构域可以将该家族划分为11种亚类[7,8]，且不同结构的TRIM分子生物学功能存在差异[9]。TRIM蛋白多数见于真核生物，其成员总数与物种进化的程度有关，例如，在人体中有80多种成员[10-14]，猪中有61种[15]，小鼠中约有64种，虫类中约有20种，苍蝇中少于10种，这也说明TRIM家族分布广泛[16]。TRIM蛋白能抵抗病毒感染，参与炎症反应、自噬和肿瘤生长调节等多种生物进程[2]。TRIM蛋白主要通过3种途径抵抗病毒感染：一是直接与病毒的核酸和衣壳蛋白相互作用；二是间接影响免疫相关信号通路进而抑制病毒的感染和复制过程；三是与其它抗病毒因子共同抵御外来病毒的入侵[17]。TRIM21蛋白可抑制HIV和鼠腺病毒的复制，又可促进HSV-1的感染，还可诱导IRF3/7和DNA感受器如DDX4的泛素化，提示TRIM21蛋白可激活IFN-I通路和抗病毒先天免疫[3]。此外，TRIM21蛋白还作为一种抗体受体，可通过HBx抗体依赖的胞内中和机制抑制HBV的增殖[18]。本研究将对猪TRIM21基因进行克隆和序列分析，为进一步揭示其免疫学特点奠定理论基础。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages，PAMs)由本实验室保存；TRIzol®Reagent试剂购自上海碧云天生物科技有限公司；反转录试剂盒、DL10 000 DNA Marker、DL 2000 DNA Marker、琼脂糖凝胶回收试剂盒、pCE2 TA/Blunt-Zero载体、DH5α化学感受态细胞均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，其它试剂为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 引物设计与合成

参考NCBI网站TRIM21序列设计引物，预计扩增片段大小为1 401 bp。上游引物：5′-ATGGCCTCAGCACTGCC-3′，下游引物：5′-CTACCAGCCCGTCCTCA-3′，引物由广州天一辉远基因科技有限公司合成。

1.2.2 总RNA提取

将PAMs悬液置于无菌无酶的1.5 mL离心管中，4 000 r/min离心10 min，加入750 μL TRIzol®Reagent裂解细胞，参照TRIzol®Reagent试剂说明书提取细胞总RNA。

1.2.3 反转录

反转录实验按照产品说明书进行，具体步骤如下：首先,在无菌无酶离心管中加入1 μL Oligo(dT)18，2 μL总RNA，5 μL RNase-free ddH2O，于65 ℃加热5 min后，迅速置于冰上冷却。然后配置cDNA合成反应液：取上一步混合液8 μL，加入10 μL 2×RT Mix和2 μL HiScript Enzyme Mix，使用移液枪充分吹打混匀。最后在50 ℃条件下反应45 min，随后在85 ℃条件下反应5 min进行反转录反应。

1.2.4 PCR反应

对反转录后的cDNA进行PCR扩增，反应条件如下：95 ℃条件下预变性5 min，95 ℃条件下15 s，60 ℃条件下反应15 s，72 ℃反应产物2 min，共35个循环，然后72 ℃充分延伸5 min。使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，胶图用凝胶成像系统分析。

1.2.5TRIM21基因的克隆与测序

回收目的片段，将纯化PCR产物连接于pCE2 TA/Blunt-Zero载体上，使用DH5α化学感受态细胞进行转化，挑取阳性菌落并接种至含氨苄抗生素的培养基，在37 ℃条件下培养16 h，然后使用PCR对菌液进行鉴定，最后将阳性克隆送至广州天一辉远基因科技有限公司测序。

1.2.6TRIM21基因生物信息学分析

采用DNAStar软件，将NCBI网站猪TRIM21基因序列与其它物种序列进行比对，参考序列见表1。参照前人已经报道的方法，采用多种生物信息学软件对猪TRIM21基因进行生物学信息分析[19]。利用在线软件ExPASy的ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)程序预测TRIM21蛋白基本的理化性质，利用ProtScale(https://web. expasy.org/protscale/)程序预测TRIM21蛋白的亲/疏水性。

表1 参考序列信息

2 结果

2.1 PCR扩增结果

从PAMs提取总RNA，经反转录获得TRIM21基因的cDNA片段。以该cDNA片段为模板进行PCR扩增，得到约1 401 bp的片段。阳性菌落PCR扩增产物与TRIM21基因PCR扩增产物大小相似，符合预期结果，说明质粒构建成功，结果见图1。

M1，DL10 000 DNA Marker；1，猪TRIM21基因PCR扩增产物；M2，DL2 000 DNA Marker；2，菌液PCR扩增产物图1 猪TRIM21基因PCR扩增结果

2.2 核苷酸相似性及系统进化树分析

将猪TRIM21基因核苷酸序列与其它物种对比，结果显示猪TRIM21基因与其它物种核苷酸的相似性为47.7%～86.0%，其中黄牛与猪的相似性最高(86.0%)，斑马鱼最低(47.7%)，结果见图2。对比猪TRIM21基因序列与参考物种的TRIM21基因序列绘制系统进化树。进化树分析表明黄牛和山羊TRIM21位于同一分支，与猪TRIM21位于同一亚分支，三者亲缘关系较近，斑马鱼与猪亲缘关系最远，结果见图3。

图2 TRIM21核苷酸相似性比对

图3 TRIM21基因序列的进化分析

2.3 TRIM21蛋白的生物信息学分析

对猪TRIM21蛋白分子进行生物信息学分析，其分子式为C2372H3710N670O697S25，由469个氨基酸组成。分子质量为53.57 ku，理论等电点为6.07，偏酸性。该蛋白含20种氨基酸，含量最多的是亮氨酸(占比10.7%)，其次为谷氨酸(占比9.8%)，结果见表2。该蛋白稳定系数为60.66，属于不稳定蛋白。对猪TRIM21蛋白进行亲/疏水性分析，结果显示第274位氨基酸有最大疏水值1.711，第151位有最小亲水值(-3.111)，亲疏水性平均值为-1.4，说明TRIM21为亲水性蛋白，结果见图4。

表2 猪TRIM21蛋白的氨基酸组成

图4 猪TRIM21蛋白亲/疏水性分析

3 讨论

本研究克隆了猪TRIM21基因，通过在线软件对该基因进行生物信息学分析。将猪TRIM21基因与其它物种进行核苷酸相似性比对，比对结果与系统进化树分析结果一致，其中猪与黄牛、山羊位于同一亚分支，说明猪与黄牛、山羊亲缘关系较近，和其它生物亲缘关系较远。TRIM21基因在不同物种间存在差异，表明其抗原性也会存在差异。软件预测显示猪TRIM21蛋白属于亲水性蛋白，且不稳定系数较高，具有较强的抗原性和良好的柔韧性，表明该基因适合作为抗原制备抗体。有报道称TRIM21蛋白可以活化NF-κB等信号通路[20]，进而激活先天免疫反应和抗病毒效应，也可通过K48介导的泛素化作用，进而通过负调节发挥先天免疫应答的作用。从抗原性和亲水性分析来看，TRIM21蛋白基因具有较强的亲水性和抗原性，适合制备单抗。

TRIM21是由三种结构域组成的蛋白，其中与抗病毒免疫密切相关的结构域是PRYSPRY[21]。该结构域可与具有抗病毒活性的蛋白结合，从而发挥抗病毒功能[22]。TRIM21蛋白之所以能发挥抗病毒活性，不仅与PRYSPRY结构域有关，还与其作为抗体的Fc受体参与先天免疫有关[20]。作为一种Fc受体，TRIM21蛋白目前仅在哺乳动物的细胞质中被发现，当IgG、IgM和IgA及同型抗体包裹的病毒进入细胞质时，TRIM21能迅速识别并中和病毒，从而抑制病毒复制[23]。此外，TRIM21作为一种E3泛素连接酶，可使机体细胞因子参与抗病毒先天免疫，并在机体内保持稳定。IRF1和IRF2在抗病毒防御反应和自身免疫性疾病中能诱导TRIM21蛋白表达，发挥重要的免疫防御作用[24]。蛋白如何介导抗体与补体在宿主和病毒蛋白之间发挥作用，将成为下一步研究的内容。

TRIM21蛋白广泛参与机体的先天免疫和获得性免疫，能对各种病原体的入侵发挥不同的免疫防御作用。本研究对猪TRIM21基因的相关功能初步探索，这不仅有利于更好地了解机体自身免疫系统的特点，同时也为一些病原微生物如病毒感染相关疾病的预防与治疗提供新思路，为该基因成为某些感染性疾病的生物标志分子提供参考，在动物疾病诊断中具有重要意义。