张桂枝，白珂瑞，靳双星

(1.河南牧业经济学院，河南 郑州 450046；2.河南省家禽疾病防控工程技术研究中心，河南 郑州 450046)

抗生素在畜牧养殖中使用存在药物残留、环境污染和细菌耐药性等问题。自2020年7月1日起，饲料生产企业停止生产含有抗生素的商品饲料。寻找安全、高效、低成本的抗生素替代品成为当务之急。

植物精油来源于天然植物，具有抗氧化、抑菌、调节免疫力、促生长等作用[1-6]。牛至油是从植物牛至中提取出来的一种淡黄色、澄清、油状液体，其主要成分是香芹酚和百里香酚。牛至油、香芹酚和百里香酚对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、葡萄牙念珠菌均具有显著的抑菌作用[7]。含25%百里香酚和25%香芹酚的精油能够抑制产气荚膜梭菌的致病力[8]。饲料中添加牛至油能调节蛋鸡肠道微生物区系平衡，改善肠道消化吸收功能，提高饲料利用率，改善鸡蛋品质[9]。饲料中添加牛至油可减少仔猪盲肠内大肠杆菌数量，改善仔猪的免疫状态和肠道屏障的完整性[10]。丁酸钠具有维护动物胃肠道内有益微生物菌群、促进胃肠道细胞的增殖和成熟等作用。基础日粮中添加0.05%丁酸钠可以提高黄鸡屠宰性能，改善肠道微生物菌群，提高肉质脂肪酸水平[11]。21日龄断奶仔猪采食含0.2%丁酸钠的饲粮，其腹泻率和腹泻指数分别较对照组降低85.78%和59.89%[12]。

目前,关于牛至油与丁酸盐协同抗菌作用的研究较少。本试验研究牛至油与丁酸钠联合的体外抑菌作用，旨在为开发新型绿色饲料添加剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

大肠杆菌ATCC25922、沙门氏菌ATCC14028、金黄色葡萄球菌ATCC25923、绿脓杆菌ATCC27853、链球菌ATCC21059、多杀性巴氏杆菌ATCC12948均购自国家标准菌种库。

1.1.2 药品

牛至油购自Aladdin公司。丁酸钠(含量≥98%)购自河南省万家标准物质研发中心有限公司。普通营养琼脂培养基和营养肉汤培养基均购自北京奥博星生物技术有限责任公司。胎牛血清购自浙江天康生物科技有限公司。

1.1.3 主要仪器

FA2204N型分析天平。DH6000II型电热恒温培养箱。YXQ-LS-100型高压灭菌锅。SW-CJ-2FD型超净工作台。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化

在标准菌株管内，将6种标准菌株冻干品分别加标准菌株复溶液500 μL，待溶解均匀后，用接种环挑取菌液划线接种于营养琼脂斜面，37 ℃培养24-48 h后，放入4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 菌悬液的配制

用接种环分别从培养平板上挑取3～4个大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌菌落接种于普通肉汤培养基中；分别挑取3～4个链球菌、巴氏杆菌菌落接种于10%血清肉汤培养基中。均在37 ℃培养16 h，制成菌悬液。

采用10倍逐级稀释法稀释菌悬液，将稀释后的菌液接种于营养琼脂平板上，37 ℃培养24 h，计数菌落数，计算1 mL菌悬液中的细菌总数。用营养肉汤将每种试验菌悬液调整为(1～2)×108cfu/mL(抑菌试验)和(1～2)×106cfu/mL[最小杀菌浓度(MBC)测定、联合抑菌试验]。

1.2.3 抑菌试验

采用K-B法。吸取100 μL供试菌液，接种于营养琼脂平板表面，用涂布棒均匀铺满整个平板。牛至油的浓度(体积分数)用丙酮稀释为200 μL/mL，丁酸钠的浓度(质量浓度)用灭菌蒸馏水配制成100 mg/mL。用灭菌镊子夹住空白药敏纸片，贴于涂有试验菌液的琼脂平板表面，每个平板表面贴3个，分别吸取10 μL牛至油供试液、丁酸钠供试液和丙酮原液滴加到空白药敏纸片上。每个样品做5个平行试验。平板倒置，于37 ℃培养箱内培养24 h后，用游标卡尺测定抑菌圈直径，结果取5个平行样的平均值。

1.2.4 最小抑菌浓度(MIC)测定

牛至油和丁酸钠溶液的制备：用灭菌的丙酮将牛至油的浓度(体积分数)稀释为256 μL/mL，丁酸钠的浓度(质量浓度)用灭菌蒸馏水配制成256 mg/mL。

MIC测定采用微量稀释法。取96孔培养板，用移液枪在一横排的1-12孔中各加100 μL营养肉汤培养基。取100 μL牛至油供试液加入第1孔，反复吹打4～5次混匀后，吸出10 μL加至第2孔，依次倍比稀释至第10孔，从第10孔中吸出100 μL弃去。在第1-11孔中分别加入供试菌悬液100 μL，第11孔为阳性对照孔，第12孔加100 μL牛至油溶液作为药液对照。密封培养板，37 ℃培养24 h观察细菌生长状况。试验结果判定：将96孔培养板在衬有黑色物质背景下观察，以无培养物生长的最低药物浓度为MIC，每种药物试验重复5次，取平均数。

1.2.5 MBC和杀菌率测定

MIC试验培养结束后，从每个试验孔中分别取出培养液100 μL，滴入琼脂平板表面，用灭菌涂布棒涂布均匀。将平板倒置于恒温培养箱内，37 ℃培养24 h，观察并记录数据。以平板上没有菌落生长的最小药物浓度为MBC，有菌落生长的平板进行菌落计数，计算杀菌率。杀菌率=(阳性对照组菌落数-试验组菌落数)/阳性对照组菌落数×100%。

1.2.6 牛至油和丁酸钠的联合抑菌试验

采用棋盘稀释法测定牛至油与丁酸钠的联合抑菌作用[13]。以单药MIC试验结果为依据，将两药进行7×7联合。选取96孔培养板，选择A-H排的1-8孔为试验区。将丁酸钠的7个浓度由高到低分别加入第1-7纵列，每孔50 μL药液，第8纵列作为牛至油单药对照；将牛至油的7个浓度由高到低分别加入第A-G排，每孔50 μL药液，H排作为丁酸钠单药对照。丁酸钠和牛至油的单药对照孔内加入相应浓度的药液100 μL。最后各孔加入1×106cfu/mL菌悬液100 μL。密封细胞板，在37℃下培养24 h，观察细菌生长状况。每组试验重复5次，取平均数。分级抑菌浓度(FIC)指数=丁酸钠联合用药MIC/丁酸钠单独用药MIC+牛至油联合用药MIC/牛至油单独用药MIC。FIC≤0.5为增强作用，0.52为拮抗作用。

2 结果与分析

2.1 牛至油和丁酸钠单独抑菌效果

由表1可知，牛至油对大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌均有很强的抑菌作用，对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强，抑菌圈平均直径为24.30 mm；对绿脓杆菌的抑菌作用相对较差，但也达到了中度敏感，抑菌圈平均直径为15.20 mm。丙酮和丁酸钠对6种细菌均无抑制作用。

表1 牛至油和丁酸钠对6种细菌的抑菌圈直径 mm

2.2 MIC测定结果

由表2可知，牛至油对6种细菌的生长均有抑制作用，对金黄色葡萄球菌的MIC最低，为2 μL/mL；其次是大肠杆菌和沙门氏菌，MIC均为4 μL/mL；对多杀性巴氏杆菌和绿脓杆菌的MIC较高，为16 μL/mL。MIC测定结果与抑菌圈直径测定结果相吻合。丁酸钠对6种细菌的MIC均为128 mg/mL。

表2 牛至油和丁酸钠对6种细菌的MIC

2.3 MBC和杀菌率测定结果

牛至油对6种细菌的MBC和杀菌率见表3。由表3可知，随着牛至油浓度的增加，对6种细菌的杀菌效果逐渐增强。牛至油对金黄色葡萄球菌的杀菌效果最强， MBC为2 μL/mL；牛至油浓度为1 μL/mL时对金黄色葡萄球菌的杀菌率达84.35%。牛至油对大肠杆菌和沙门氏菌也有很好的杀菌作用，MBC均为4 μL/mL；牛至油浓度为2 μL/mL时对大肠杆菌和沙门氏菌的杀菌率分别为79.35%和87.42%。对链球菌、多杀性巴氏杆菌和绿脓杆菌的MBC分别为8、16、32 μL/mL。

表3 牛至油对6种细菌的杀菌率 %

2.4 牛至油与丁酸钠联合抑菌效果

由表4可知，牛至油、丁酸钠单药对大肠杆菌的MIC分别为4 μL/mL和128 mg/mL。二者联合，牛至油浓度为0.5 μL/mL、丁酸钠浓度为1 mg/mL，即可抑制大肠杆菌的生长，FIC指数为0.13，两药联合表现为增强作用。

表4 牛至油与丁酸钠联合对6种细菌联合抑菌效果

牛至油、丁酸钠单药对沙门氏菌的MIC分别为4 μL/mL和128 mg/mL。二者联合，牛至油浓度为2 μL/mL、丁酸钠浓度为1 mg/mL，即可抑制沙门氏菌的生长，FIC指数为0.51，两药联合表现为相加作用。

牛至油、丁酸钠单药对多杀性巴氏杆菌的MIC分别为16 μL/mL和128 mg/mL。二者联合，牛至油浓度为2 μL/mL、丁酸钠浓度为2 mg/mL，即可抑制多杀性巴氏杆菌的生长，FIC指数为0.14，两药联合表现为增强作用。

牛至油、丁酸钠单药对绿脓杆菌的MIC分别为16 μL/mL和128 mg/mL。二者联合，牛至油浓度为16 μL/mL、丁酸钠浓度为1 mg/mL，即可抑制绿脓杆菌的生长，FIC指数为1.01，两药联合表现为无关作用。

牛至油、丁酸钠单药对金黄色葡萄球菌的MIC分别为2 μL/mL和128 mg/mL。二者联合，牛至油浓度为2 μL/mL、丁酸钠浓度为1 mg/mL，即可抑制金黄色葡萄球菌的生长，FIC指数为1.01，两药联合表现为无关作用。

牛至油、丁酸钠单药对链球菌的MIC分别为8 μL/mL和128 mg/mL。二者联合，牛至油浓度为4 μL/mL、丁酸钠浓度为1 mg/mL，二者联合即可抑制链球菌的生长，FIC指数为0.51，两药联合表现为相加作用。

3 讨论

本试验结果表明，牛至油对大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌的生长均有抑制作用，随着牛至油浓度的增加，其抑菌作用增强，达到一定浓度后有完全杀菌作用。牛至油对金黄色葡萄球菌的抑制效果最强，其次是对大肠杆菌的抑制效果。Chao等[14]发现,牛至油对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制作用，这与本试验的结果一致。牛至油的抗菌作用主要是通过其所含的百里香酚和香芹酚实现的，百里香酚和香芹酚作用于细菌的细胞膜，改变细胞膜的通透性，或与细胞膜中的磷脂反应，破坏蛋白质合成，从而抑制细菌生长[15]。

植物精油协同抑菌的研究集中在不同植物精油之间的协同和植物精油与其他抑菌物质联用两个方面。植物精油中添加丁酸有助于增强植物精油中活性成分的抗菌作用[16]。韩乾杰等[17]研究复合植物精油和丁酸钠之间的协同作用，发现丁酸钠能够减少复合植物精油的使用量达75%，同时淡化了植物精油的浓郁气味。植物精油与柠檬酸复合对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌均有明显抑菌作用[18]。肉鸡饲粮中添加丁酸钠与植物精油的混合物显著提高小肠绒毛长度/隐窝深度的比值，并且显著减少产气荚膜梭菌的数量[19]。本试验结果表明，牛至油与丁酸钠联合对大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌和链球菌的抑制有协同增效作用。对于大肠杆菌和多杀性巴氏杆菌，丁酸钠的加入可以减少牛至油用量达87.5%。对于沙门氏菌和链球菌，丁酸钠的加入可以减少牛至油用量达50%。

4 结论

牛至油对大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌的生长均有抑制作用，对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强。丁酸钠对6种细菌均没有明显的抑制作用。牛至油与丁酸钠联合对大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌和链球菌的抑制有协同增效作用，可显著降低牛至油的使用量。