苏 静， 许 芳， 胡 宏， 文菁菁

(绵阳市中心医院血液内科，四川省绵阳市621000)

淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma，HL)和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)[1]，HL和NHL的临床表现和组织病理特征存在明显的差异，虽然放射治疗、化疗、造血干细胞移植等取得明显进展，但由于淋巴瘤的高度异质性，其预后往往不甚理想。因此，随着靶向治疗的发展，分子靶点和分子靶向药物成为淋巴瘤治疗的重要突破口[2]。肿瘤坏死因子受体2(tumor necrosis factor receptor 2，TNFR2)主要表达于造血细胞和内皮细胞，具有抗炎、促进骨折愈合，以及抗脂多糖诱导的肺损伤的作用[3]。此外，TNFR2与肿瘤发生发展也有着密切的联系，TNFR2可促进卵巢癌[4]、肺癌[5]、乳腺癌[6]细胞迁移和侵袭，但其在淋巴瘤发生发展中的作用尚不明确。本研究观察了TNFR2对HL细胞系L428细胞增殖活性及阿霉素(adriamycin amycin，ADM)耐药的影响，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

PcDNA3.1/TNFR2载体质粒(大连宝生物工程公司)；DDK-1(北京诺博莱科技有限公司)；沙利度胺购于常州制药厂,为纯品原料药, 溶于二甲基亚砜(DMSO) 后得50 g/L的母液,处理L428为300 mg/L沙利度胺；ADM(浙江海正药业股份有限公司， H33021980)。RIPA裂解液、细胞培养箱、Trizol、PrimeScript qRT-PCR试剂盒(赛默飞世尔)；Kit试剂盒、BCA试剂盒、CCK-8试剂盒(武汉艾迪抗生物科技有限公司)；LY294002、TNFR2、磷酸化蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(phosphorylated protein serine threonine kinase,p-Akt)、Akt、β-4-4catenin和GAPDH一抗(Sigma公司)；ABI7500实时荧光定量PCR仪(迪图上海生物科技有限公司)；FT-SY96S酶标仪、垂直电泳仪(美国Bio-RAD公司)。

1.2 细胞培养、转染和分组

L428细胞购自上海邦景实业有限公司，采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，置于37 ℃、5%CO2、97%湿度培养基中培养，每2～3天换1次培养基。细胞分为6组：转染空白质粒的对照组、转染PcDNA3.1/TNFR2的上调组(upregulation group，UR组)、上调TNFR2并抑制Akt组(LY294002组，LY组)及上调TNFR2并抑制WNT通路组(DKK1组，DK组)、L428细胞过表达TNFR2并沙利度胺处理后的对照组和UR组。UR、LY和DK采用细胞系核仁转染试剂盒将PcDNA3.1/TNFR2载体转染L428细胞，上调TNFR2表达，按照实际和说明书进行转染操作，转染后48 h收集转染细胞用于进一步研究。

1.3 qRT-PCR

采用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，用PrimeScript qRT-PCR试剂盒将RNA反转录为cDNA，均参照试剂盒说明书进行操作。采用Kit试剂盒进行PCR检测，用Labwork软件进行结果分析。采用2-ΔΔCt法计算TNFR2相对表达量。引物序列：TNFR2上游5′-ACGTTCTCCAACACGACTTCATC-3′，下游5′-ATGATGACACAGTTCACCACTCC-3′；GAPDH上游5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。

1.4 Western blot

收集转染细胞，加入蛋白裂解液，提取总蛋白，采用BCA试剂盒进行定量。取300 μg蛋白经10%SDS-PAGE分离后转移到硝酸纤维素膜上，含5%脱脂奶粉的TBS室温封闭1 h，加入TNFR2(稀释比例1∶1 000)，磷酸化Akt(稀释比例1∶1 000)，Akt(稀释比例1∶1 000)，β-4-4catenin(稀释比例1∶1 000)和GAPDH(稀释比例1∶5 000)一抗孵育，4 ℃摇床过夜，次日PBST洗3次，每次10 min，二抗室温孵育1 h，曝光后对蛋白进行定量，以GAPDH作为内参。

1.5 CCK-8法检测细胞增殖活力及耐药性分析

收集转染后细胞，以5×103个/孔接种于96孔板中，接种后12、24、48 h时，加入10 μL CCK-8溶液，2 h后在450 nm处读取OD值，实验重复3次。收集转染后细胞，以8×103个/孔接种于96孔板中，24 h后以不同浓度ADM(0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μmol/L)替代培养基，以0 μmol/L ADM处理的细胞作为对照组。48 h后，加入10 μL CCK-8溶液，2 h后在450 nm波长处读取OD值，绘制细胞活力曲线，细胞活力(%)=各浓度OD值/对照组OD值×100%。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 各组TNFR2 mRNA和蛋白表达的比较

UR、LY和DK组TNFR2 mRNA和蛋白表达均高于对照组(P<0.05；图1)。

图1 各组细胞中TNFR2 mRNA(A)和蛋白(B和C)表达的比较

2.2 各组Akt和WNT信号通路蛋白的比较

UR、LY和DK组p-Akt/Akt、β-4-4catenin均高于对照组，LY组p-Akt/Akt水平低于UR组，DK组β-4-4catenin水平低于UR组和LY组(P<0.05)。在L428细胞过表达TNFR2并采用沙利度胺处理后，沙利度胺UR组较UR组细胞中p-Akt/Akt及β-4-4catenin水平均明显降低(P<0.05；图2和表1)。

图2 各组Akt和WNT信号通路蛋白相对表达的比较

表1 各组Akt和WNT信号通路蛋白表达的比较(n=6)

2.3 各组细胞增殖能力的比较

12、24、48 h时UR组、LY组、DK组细胞活力OD值均高于对照组，LY组和DK组低于UR组(P<0.05；表2)。在L428细胞过表达TNFR2并采用沙利度胺处理后，沙利度胺UR组12、24、48 h OD值均低于UR组(P<0.05；表2)。

表2 作用不同时间各组细胞增殖能力的比较

2.4 各组ADM后IC50的比较

对照组、UR、LY和DK组ADM的IC50分别为0.821、1.785、1.135和1.195 μmol/L，UR、LY和DK组IC50高于对照组，LY和DK组IC50低于UR组(P<0.05；图3)。在L428细胞过表达TNFR2并采用沙利度胺处理后，对照组、沙利度胺对照组、UR组、沙利度胺UR组IC50分别为0.762、0.798、1.815和1.154 μmol/L，沙利度胺UR组IC50低于UR组(P<0.05；图3)。

图3 各组ADM抑制L428细胞活力的IC50比较

3 讨 论

肿瘤坏死因子受体相关因子是三聚体结合蛋白家族，与肿瘤坏死因子家族受体不同成员的胞质区域和Toll样受体复合物的组成部分相互作用[7]。TRAF2定位于9q34.3，编码501个氨基酸，在乳腺癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤中表达上调，参与癌症的发生、增殖、侵袭和转移等多种病理生理进程，但在淋巴瘤的研究中较少报道[8-9]。目前TNFR2在淋巴瘤中报道仅限于血浆中可溶性的TNFR2，既往研究显示，血浆高水平TNFR2与HL患者临床特征和预后不良相关[10]。Heemann等[11]研究显示，循环血液中可溶性TNFR2水平≥2.16 μg/L时，患者总生存时间缩短相对风险增加2.07倍，无进展生存时间缩短风险增加2.49倍。Nakamura等[12]研究显示，接受R-CHOP方案化疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者，循环高水平可溶性TNFR2与预后较差相关。这些研究均显示，血浆中可溶性TNFR2与淋巴瘤预后相关，但TNFR2在淋巴瘤中的具体作用尚不明确。

Akt途径是介导各种生理和病理通路的关键性通路，参与到了肝癌、肺癌、胰腺癌、淋巴瘤等多种肿瘤的恶性生物学功能中，如肿瘤细胞增殖、存活、黏附、耐药性和迁移等[13]。一项胆管癌研究显示，使用中和抗体抑制TNFR2表达可阻断乳腺癌细胞中Akt信号通路的激活[14]。Wnt/β-4-4catenin信号已被证明是癌症发生的核心，可影响细胞增殖、迁移、耐药性等多种恶性肿瘤细胞相关特征[15]。本研究中上调TNFR2表达可增加p-Akt/Akt比值和β-4-4catenin蛋白表达水平，Akt抑制剂LY294002可抑制TNFR2过表达所致L248细胞增殖，Wnt/β-4-4catenin抑制剂DKK1也可抑制TNFR2过表达导致的L248细胞增殖，结果提示TNFR2过表达与淋巴瘤L428细胞增殖相关，Akt和WNT/β-4-4catenin途径可能是TNFR2促进肿瘤增殖的重要机制。有研究报道，沙利度胺可以作为TNFR2的抑制剂[16]，为了观察L428后续的生物学恶性行为是否通过TNFR2，在过表达TNFR2后，使用沙利度胺对TNFR2进行抑制后，L428细胞的p-Akt/Akt比值和β-4-4catenin的表达水平明显下降，同时沙利度胺处理后的细胞增殖率明显降低。

ADM是治疗淋巴瘤的常规化疗药物，通过嵌合在DNA碱基对之间干扰转录过程，阻止mRNA合成，对各期细胞均有治疗作用，但长期使用易产生耐药性，药物获得性耐药是治疗的巨大阻碍，研究淋巴瘤耐药机制和逆转耐药是临床亟待解决的问题[17]。本研究中，UR组IC50显著高于对照组，提示TNFR2表达增加可能与淋巴瘤L428细胞ADM耐药性相关，进一步研究显示，抑制Akt和Wnt/β-4-4catenin通路均可部分逆转TNFR2表达增加导致的ADM耐药，同时采用沙利度胺对TNFR2进行抑制后，也可以部分逆转TNFR2表达增加导致的ADM耐药。本结果与既往循环可溶性TNFR2和淋巴瘤预后的报道相一致[17]。

综上所述，TNFR2通过Akt和WNT/β-4-4catenin途径促进淋巴瘤L428细胞增殖和ADM耐药，TNFR2可能是淋巴瘤治疗的新靶点。