江 岚， 邓 强， 龙鼎新

(1.湖南环境生物职业技术学院，湖南省衡阳市421001; 2.南华大学衡阳医学院公共卫生学院，湖南省衡阳市421001)

蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要依赖于Ca2+和磷脂激活，Ca2+作为第二信使广泛存在于细胞内，Ca2+信号的释放会引起细胞死亡机制触发，下游表型体现，进而参与调节增殖分化、胞内分子分泌、自噬和凋亡等各种细胞生理过程[1]，通过磷酸化来介导其他蛋白的功能[2]。已知PKC共有10个亚型，其可分为3组：常规PKC(cPKC)包括α、βI、βII和γ亚型；新型PKC(nPKC)包括δ、ε、η和θ亚型；非典型PKC(aPKC)包括ι(也称为小鼠λ)和ζ亚型[3]。PKCα广泛存在于哺乳动物的肌肉、脑、肺、皮肤、心等组织中[4]。PKCα含有C1和C2结构域，其可以通过二酰基甘油(DAG)和Ca2+在磷脂酰丝氨酸的存在下被激活，并参与多种生物学功能，包括细胞周期进程、肿瘤发生、迁移和自噬[4]。例如PKCα使滋养层细胞表面抗原2(Trop-2)磷酸化，增强了细胞运动能力[5]；敲低PKCα可以降低LC3-II和自噬通量的水平[6]。PKCα还与多种疾病的发生发展相关，如PKCα在糖尿病妊娠中通过miR-129-2抑制自噬并诱导神经管缺陷[7]；在炎性关节炎疼痛模型中，PKCα上调伤害性背根神经节神经元的钠通道Nav1.9[8]；苹果树酚类提取物可通过调节PKCα信号通路并减轻铅(II)暴露小鼠的内质网应激来维持肝肾功能[9]；PKCα通过刺激自噬通量调节肾纤维化和成纤维细胞活化[10]。

细胞内含有非常多样的与PKCα直接相互作用的蛋白分子，可以很好地调节其活性，在很多信号通路中，PKCα都发挥着重要的作用，在细胞信号转导中处于中枢地位，是多种信号途径的整合者。本文基于生物信息学方法，对人PKCα蛋白结构和功能进行分析，为PKCα的机制研究等提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 人PKCα蛋白序列的获得

通过NCBI数据库http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/检索人PKCα序列，下载人PKCα蛋白的氨基酸序列。

1.2 蛋白跨膜结构分析

采用CBS中的TMHMM Serverv.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)，通过在线的方式针对人PKCα蛋白跨膜结构进行预测。

1.3 亚细胞定位分析

对人PKCα蛋白进行亚细胞定位，使用ProtComp 9.0(http://linux1.softberry.com/berry.phtml?group=programs&subgroup=proloc&topic=protcompan)分析，以获得蛋白定位结果。

1.4 蛋白质理化性质分析

对人PKCα蛋白的理化性质进行预测，主要通过ProtParam[10]程序来实现，囊括了氨基酸数量、相对分子质量、理论等电点、不稳定系数以及总平均亲水性；利用Protscale[11]程序(http://web.expasy.org/protscale)对人PKCα蛋白进行亲疏水性测定；主要采用SignalP-4.0[12]测定人PKCα蛋白有无信号肽及切割位点。

1.5 磷酸化位点分析

使用NetPhos 2.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetP hos/)针对人PKCα蛋白磷酸化位点通过在线的方式来进行预测。

1.6 蛋白质二级结构和三级结构分析

采用PHD(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_seccons.html)在线预测人IP3R蛋白二级结构。采用SWISS-MODL对PKCα三级结构进行预测。

1.7 蛋白信息和相互作用蛋白预测

利用PredictProtein(https://www.predictprotein.org/)分析跨膜螺旋区域、二硫桥以及结合位点等性质。使用STRING数据库(https://string-db.org/)在线预测人PKCα蛋白相互作用网络。

2 结 果

2.1 人PKCα蛋白序列的查找

登陆美国国家生物技术信息中心数据库，下载获得人PKCα蛋白氨基酸序列，其NCBI序列号为BAU98542.1。

2.2 人PKCα蛋白跨膜结构预测

蛋白质跨膜区域作为跨越细胞膜的区域，其主要存在于蛋白质序列中，通常情况下采用TMHMM在线软件来进行跨膜结构的分析，预测结果如图1所示，人PKCα蛋白无跨膜结构。

图1 人PKCα蛋白跨膜结构分析

2.3 人PKCα蛋白亚细胞定位

运用ProtComp 9.0对人PKCα蛋白进行亚细胞定位。PKCα蛋白定位在质膜上的可能性为71.4%，而定位于其他细胞器或胞外的概率并不大。

2.4 人PKCα蛋白理化性质分析

选择采用ProtParam在线分析显示人PKCα蛋白为亲水性蛋白，不稳定系数38.12%，表明该蛋白属于不稳定蛋白。针对人PKCα蛋白，依托于Protscale来分析其疏水性和亲水性，其中亲水性最强的是326位的谷氨酰胺(Q)，而位于451位的亮氨酸(L)亲水性最弱(图2)。对上述PKCα的疏水性和亲水性值进行统计，PKCα的亲水性氨基酸残基总和为-456.897，而疏水性氨基酸残基总和为116.053。PKCα经过上述分析后确定为亲水性蛋白。

图2 人PKCα蛋白疏水性和亲水性预测

2.5 人PKCα蛋白磷酸化位点预测

对人PKCα蛋白的磷酸化位点预测，粉色线条以上表示阈值超过0.5，不同颜色柱状表示不同氨基酸Ser、Thr、Tyr。结果显示，人PKCα蛋白含23个Ser，19个Thr，9个Tyr，可能作为蛋白激酶磷酸化位点存在(图3)。

图3 人PKCα蛋白的磷酸化位点

2.6 人PKCα蛋白信号肽切割位点结果

对人PKCα蛋白信号肽及切割位点进行预测。结果显示并不存在信号肽位点，因此可以将其判定为非分泌性蛋白(图4)。

图4 人PKCα蛋白信号肽预测

2.7 人PKCα蛋白质二级结构预测

PKCα蛋白质含有大量无规则卷曲，约占52.68%，推测无规则卷曲为PKCα最大量的二级结构原件，余下依次为α-螺旋约占23.36%和延伸链约占23.96%(图5)。

图5 人PKCα蛋白的二级结构分析

2.8 人PKCα蛋白信息预测

以PredictProtein对人PKCα蛋白的蛋白质序列及结构进行有效预测，获得跨膜螺旋等信息。PredictProtein预测结果为PKCα有15个蛋白结合位点，无跨膜螺旋区域在预测结果方面等同于TMHMM，并不存在任何的二硫键(图6)。

图6 PKCα结合位点、跨膜螺旋区域、二硫键预测

2.9 人PKCα蛋白互作网络及功能预测

人PKCα蛋白主要与PICK1、SDC4、BRAF、AKAP150和PLD1等蛋白质相互作用。对人PKCα蛋白互作蛋白进行GO分析，PKCα分子功能本体论结果表明：该蛋白具有蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、转移酶活性、激酶活性、磷酸转移酶活性、转移酶活性、杂环化合物的结合、核苷磷酸结合和小分子结合等的可靠性较高(表1)；PKCα生化过程本体论结果表明：该蛋白参与细胞代谢过程、高分子改性、蛋白质磷酸化、细胞蛋白修饰过程、细胞蛋白质代谢过程、细胞大分子代谢过程、初级代谢过程等的可靠性较高(表2)；PKCα细胞成分本体论结果表明：该蛋白参与细胞内的部分、细胞质、胞内膜结合细胞器、细胞内的细胞器、膜结合细胞器、核等的可靠性较高(表3)。

表1 PKCα分子功能本体论

表2 PKCα生化过程本体论

表3 PKCα细胞成分本体论

2.10 人PKCα蛋白三级结构分析

采用SWISS-MODL对人PKCα蛋白三级结构进行预测，GMQE在此处具体为0.73，QMEAN在此处具体为-2.64，序列与3pfq.1.A模板序列具有非常高的相似度，达到了79.85%，这意味着该模型具有相对合理的结构。该蛋白质扭曲非常多，拥有着丰富的结构，此类结构对生物学功能的发挥有重要作用(图7)。

图7 人PKCα蛋白三级结构预测

3 讨 论

生物信息学是一门以计算机为手段，综合运用生物学、信息科学、数学等多学科方法的交叉学科。其主要是对大量的生物信息进行获取、处理、储存、分析和解释，进而发现新的信息和规律[13]。

PKCα在机体中扮演着极其重要的角色，PKCα研究快速推进，本课题第一次对PKCα蛋白的跨膜结构、理化性质和二级结构等进行分析。结果显示PKCα蛋白定位于胞膜和无跨膜结构，预测其为亲水性蛋白。有研究报导，PKCα能被第二信使Ca2+和二酰基甘油(DAG)激活，从无活性的胞质状态转变为活性的膜相关状态，这种构象转变用以调节多种细胞过程，如基因表达[14]、迁移[15]、增殖[16]和细胞凋亡[17]。而PKCα蛋白C末端区域的保守基序的疏水性区域在调节其活性中起着双重作用：通过对细胞内Ca2+的敏化而激活，通过与C2结构域的保守带正电区域相互作用而自动抑制[18]。后续蛋白信息预测PKCα蛋白具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性、激酶活性等，与前人结果一致。蛋白二级结构结果显示无规则卷曲以及α-螺旋作为PKCα核心二级结构原件。在细胞内，磷酸化以及去磷酸化作为重要传导途径，因此必须要分析磷酸化位点。结果显示，PKCα蛋白所拥有的磷酸化位点主要包括了Ser、Thr和Tyr，其中最多的就是Ser位点，判断Ser蛋白激酶在蛋白磷酸化中可能扮演着极其重要的角色。最近几年，研究结果与软件预测结果一致，滋养层细胞表面抗原2(Trop-2)在Ser-322处被PKCα磷酸化，并且这种磷酸化增强了细胞运动，并降低了claudin-7定位于细胞边界[5]。其无二硫键，其表现出钙释放通道活性等。研究表明钙通过与钙传感器PKCα和钙调蛋白结合而刺激内吞作用，这对于维持突触传递和神经元网络活动至关重要[19]。蛋白质间相互作用也很关键，深入分析蛋白互作网络，可实现对这种相互作用系统了解，最终发现人PKCα蛋白主要与PICK1、SDC4、BRAF、AKAP150和PLD1等蛋白质相互作用。最新研究结果显示：PICK1是一种支架蛋白，可通过蛋白激酶PKCα(PRKCA)促进其蛋白伴侣的磷酸化调节转录活性[20]；在携带BRAF突变的黑色素瘤患者中，PKCα过表达使患者死亡风险增加11倍[21]；SDC4可以直接与绒毛外滋养细胞(EVT)中活化的PKCα结合，而抑制PKCα可以降低EVT的入侵和迁移[22]；L型Ca2+通道功能的局部控制受AKAP150靶向的PKCα信号传导调节，该信号传导在生理条件下控制持续的Ca2+内流、血管紧张度和血压，并且是血管紧张素II依赖性高血压的基础[23]；弓形虫靶向GRA7的ASC和PLD1通过PKCα促进抗菌宿主防御[24]。

本文针对人PKCα蛋白序列展开了生物信息学分。此阶段必然需要用到生物学软件和平台固定模式，软件参数设置存在着差异，导致有不同的结果，因此这一分析方法具有局限性。可以尝试采用多软件多平台综合分析，保证更为精准的预测。进而研究蛋白重要功能区域，此后通过实验对预测结果进行验证。