李翠梅， 高艳娥， 胡艳， 张良

(1.西安市第五医院妇产科，陕西省西安市 710000；2.西安交通大学第二附属医院妇产科，陕西省西安市 710004；3.陕西省肿瘤医院妇瘤科，陕西省西安市 710065)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一种以雄激素分泌紊乱为特征，可导致患者周期性紊乱和多囊卵巢的疾病，上述情况会干扰和阻碍卵泡发育，导致少排卵/无排卵和不孕[1]。现有研究表明，PCOS患者体内睾酮和黄体生成素水平较高[2]，肥胖和胰岛素抵抗风险也更高[3]。有研究已经证实了PCOS患者维生素D(vitamin D，VitD)缺乏(<50 nmoL/L)、肥胖、胰岛素抵抗和不孕之间的关系，并将VitD缺乏确定为导致高雄激素血症的主要因素[4]。以往的研究强调了VitD在女性生殖功能中的作用，如类固醇生成，可促进颗粒细胞增殖、卵母细胞活化、排卵和卵泡发育[5]。虽然VitD缺乏在PCOS患者中普遍存在，但补充VitD在PCOS患者中的作用尚不完全清楚。因而，本研究旨在评估VitD对PCOS大鼠卵泡发育、性激素变化和胰岛素抵抗的影响，以为临床提供参考。

1 材料和方法

1.1 动物、仪器和试剂

40只雌性SD大鼠(8周)购于陕西中医药大学动物中心，24 ℃受控照明(12 h光-暗循环)下自由饮食。40只大鼠随机分为对照组、PCOS组、VitD组和VitD+PCOS组，每组10只。倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)；酶联免疫吸附测定试剂盒(武汉博士德生物科技有限公司)；HE染料(美国Sigma公司)；戊酸雌二醇(拜耳医药保健有限公司广州分公司)。

1.2 PCOS模型制备及干预

大鼠腹部肌肉注射戊酸雌二醇(2 mg/kg)，60天后通过阴道涂片和血清学检查证实PCOS模型制备成功[6]。PCOS模型制备后，将2 mg VitD溶解在二甲基亚砜溶液中，VitD组和VitD+PCOS组大鼠每天皮下注射VitD(1 mg/kg)，共14天。干预结束后，测量大鼠卵巢质量和体质量。然后麻醉大鼠，心脏抽5 mL血液，3 000 r/min离心10 min，收集血浆于-70 ℃储存。

1.3 组织病理学观察

麻醉处死大鼠，切除卵巢，立即固定于4%多聚甲醛溶液中，乙醇脱水，二甲苯清除，石蜡包埋，5 μm连续切片，苏木精和伊红染色，光学显微镜下观察。如果卵泡卵母细胞完整，颗粒细胞层完整，则视为正常卵泡；如果颗粒细胞内出现空泡化和核固缩，且偶尔观察到卵母细胞萎缩，则视为闭锁卵泡。根据卵泡发育阶段将其分为原始卵泡、初级卵泡、腔前卵泡和腔卵泡。当卵母细胞的细胞核显影时进行组织形态计量学分析，计数所有卵泡，重复计数3次取均值。

1.4 卵泡活力的观察

在显微镜下机械分离不同时期卵泡，并通过膜包裹的颗粒细胞和中央卵母细胞进行评估。卵巢滤泡用0.4%台盼蓝染色，倒置显微镜检测。如果卵母细胞和周围颗粒细胞被染色，则卵泡被认为是正常；如果中央卵母细胞和周围颗粒细胞未被染色，则认为是退化卵泡。卵泡活力(%)=正常卵泡/(正常卵泡+退化卵泡)×100%。

1.5 性激素及胰岛素的测定

按照说明书使用酶联免疫吸附测定试剂盒，测定卵泡刺激素、黄体生成素、睾酮、孕酮、雌二醇水平。采用全自动生化分析仪分析血糖和胰岛素水平。胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=空腹胰岛素×空腹血糖/22.5。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠体质量及卵巢质量的比较

与对照组比较，PCOS组大鼠体质量和卵巢质量均增加(P<0.05)；与PCOS组大鼠比较，VitD+PCOS组大鼠体质量和卵巢质量均降低(P<0.05；表1)。

表1 补充VitD对PCOS大鼠体质量和卵巢质量的影响

2.2 各组大鼠卵巢组织病理学观察

对照组和VitD组大鼠组织学观察表明，不同发育阶段卵巢卵泡正常完整(图1A和C)。相比之下，PCOS组大鼠腔前卵泡和腔卵泡显示出更多的退化迹象，包括颗粒细胞固缩、颗粒细胞层变薄和大量闭锁卵泡(图1B和图2)。VitD+PCOS组大鼠卵泡发育良好，观察到正常颗粒细胞和卵膜细胞层(图1D)，说明VitD干预后PCOS大鼠卵泡成熟(卵泡发生)并排卵。

图1 各组大鼠卵巢组织HE染色(40×)A为对照组；B为PCOS组；C为VitD组；D为VitD+PCOS组。

图2 PCOS大鼠卵泡发育的不同阶段(200×)A为腔前卵泡;B为腔卵泡;C为闭锁卵泡。

2.3 各组大鼠卵泡形态和活力比较

与对照组比较，PCOS组不同发育阶段卵泡数量显著减少，正常卵泡数量显著降低，而闭锁卵泡数量明显增多(P<0.05)；与PCOS组比较，VitD+PCOS组上述变化趋势明显改善(P<0.05；表2)。

表2 补充VitD对PCOS大鼠卵泡形态的影响 单位：个(%)

与对照组比较，PCOS组不同发育阶段卵泡活力均降低(P<0.05)；与PCOS组比较，VitD+PCOS组不同发育阶段卵泡活力显著提高，且不同发育阶段退化卵泡活力显著降低(P<0.05；表3)。

表3 补充VitD对PCOS大鼠卵泡活力的影响 单位：个(%)

2.4 各组大鼠性激素和胰岛素等指标的比较

与对照组比较，PCOS大鼠血清黄体生成素、睾酮、胰岛素、血糖和胰岛素抵抗显著升高，卵泡刺激素、雌二醇和孕酮水平显著降低(P<0.05)；与PCOS组比较，VitD+PCOS组上述变化趋势明显改善(P<0.05；表4)。

表4 补充VitD对PCOS大鼠性激素、血糖、胰岛素和胰岛素抵抗的影响

3 讨 论

本研究发现，PCOS大鼠体质量和卵巢质量增加；PCOS大鼠卵巢中不同发育阶段正常卵泡数量和活力减少，闭锁卵泡数量增多；PCOS大鼠血清黄体生成素、睾酮、胰岛素、血糖和胰岛素抵抗水平升高，卵泡刺激素、雌二醇和孕酮水平降低。而补充维生D后，可以改善上述指标，这可能与VitD补充降低睾酮水平有关。本研究PCOS大鼠卵巢组织病理学观察显示，在不同发育阶段有大量卵泡受损，颗粒细胞萎缩，卵泡膜变薄；VitD补充可使PCOS大鼠卵泡发育良好，观察到正常的颗粒细胞和卵泡膜细胞层。近期有研究报道，脱氢表雄酮诱导PCOS大鼠皮下注射VitD后，与PCOS组比较，VitD组大鼠卵巢切片显示闭锁卵泡和囊状卵泡数量目减少，同时卵巢功能恢复[6]。与其研究一致，在本研究中，PCOS大鼠发育各阶段闭锁卵泡增加，生长卵泡和卵泡发育受损，而补充VitD可改善PCOS的不良作用。以往研究表明，VitD在卵巢类固醇激素的生成中起到重要的调节作用，VitD水平与抗缪勒氏管激素具有相关性，从而提高了卵泡刺激素的敏感性，促进卵泡发育成熟和排卵[7]。

PCOS是激素紊乱原因之一，可导致不明原因的不孕。VitD缺乏和高雄激素血症是PCOS发病和发展过程中的常见症状，提示VitD水平与睾酮水平呈负相关，VitD缺乏可引起高雄激素血症[8]。本研究与Pal等[9]研究一致，证明PCOS患者补充VitD后睾酮水平显著降低。有研究证实，VitD缺乏通过钙失调引起卵泡发育停止或受损，从而导致月经不调、排卵和生育功能障碍[10]。本研究结果证实VitD在卵子发生和卵母细胞成熟中的关键作用。VitD缺乏可能是PCOS卵母细胞发育障碍的原因。也有研究表明，VitD在血清性腺类固醇生成中也有作用[11]。在本研究中，VitD可能通过改善PCOS大鼠的芳香化酶活性和黄体生成素来提高雌激素水平。此外，在本研究中，PCOS大鼠卵泡刺激素水平降低，黄体生成素水平升高，卵泡成熟受损，形成多个囊性卵泡。VitD可能通过抑制抗缪勒氏管激素表达诱导颗粒细胞分化，从而使卵泡达到终末成熟。此外，在黄体化的颗粒细胞中，VitD导致颗粒细胞对卵泡刺激素依赖性降低，而对黄体生成素依赖性增加，从而使成熟卵泡排卵[12]。本研究结果证明，VitD通过增加雌激素和孕酮水平以及调节卵泡刺激素和黄体生成素比率促进PCOS大鼠卵泡发育。

有研究发现，VitD缺乏与PCOS各种症状有关，包括胰岛素抵抗、不孕和多毛症等[13]。在本研究中，补充VitD可降低PCOS大鼠血糖或胰岛素水平，PCOS大鼠存在胰岛素抵抗。越来越多的研究发现，胰岛素抵抗在PCOS患者中很常见，VitD缺乏也与胰岛素抵抗有关[14]。有证据表明，VitD可能通过刺激卵巢组织中胰岛素受体、肾素-血管紧张素-醛固酮系统和钙调节系统表达来降低胰岛素抵抗，从而增加胰岛素敏感性[15]。而胰岛素抵抗和肥胖与PCOS妇女VitD缺乏和促性腺激素分泌减少有关[16]。本研究结果提示，VitD补充可能与改善PCOS大鼠胰岛素敏感性和有效性有关。

总之，本研究结果表明，PCOS大鼠补充VitD后可能通过调节性激素及胰岛素敏感性，促进正常卵泡发育。因此，本研究进一步验证补充VitD可以保护卵巢组织免受PCOS影响。