岳壮壮， 黄玲俐， 吴添雨， 伍燕， 颜新建， 李高峰

(中南大学湘雅医学院附属株洲医院肿瘤科，湖南省株洲市 412000)

原发性肝癌是中国常见的恶性肿瘤之一，其治疗原则是以手术为主的综合治疗[1-2]。研究表明，双胍类药物氯胍在肿瘤细胞系中抗增殖作用最强[3]。代谢重编程在癌症的发生发展中起着至关重要的作用[4],在肝癌患者中调节元件结合蛋白(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)被上调，从而导致脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FASN)转录激活[5-6]。目前氯胍对肝癌细胞的作用机制暂无相关报道，本研究检测不同浓度的氯胍对Hep-G2及SMMC-7721两种肝癌细胞增殖、集落形成及迁移能力的影响，初步探讨其作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

肝癌细胞株Hep-G2(中南大学湘雅医学院基础医学院)和SMMC-7721(湖南师范大学医学院)；氯胍(中国上海阿拉丁试剂公司)；DMEM基础培养基、南美胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(美国Gibco公司)；胰蛋白酶(trypsin 0.25% EDTA)、PBS磷酸盐缓冲液、青链霉素(美国Hyclone公司)；FASN、SREBP-1c、β-actin抗体(美国CST公司)；Transwell小室(3422)(美国康宁公司)；倒置荧光显微镜-DMI3000B(德国Leica公司)；全自动化学发光图像分析系统-4600(上海天能科技有限公司)；多功能酶标仪-Synergy HTX(美国BioTeK公司)。

1.2 细胞培养

将肝癌细胞株Hep-G2及SMMC-7721培养于含10%FBS、1%青链霉素的DMEM基础培养基中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞生长达70%～80%时进行传代，取对数期细胞进行实验。所有实验重复3次。

1.3 药物配置

用PBS将氯胍配制成40 mmol/L的母液，分装后置于-20 ℃保存。用培养基将母液稀释成相应浓度后进行实验，现配现用。

1.4 MTT法检测细胞增殖

收集对数期的Hep-G2及SMMC-7721细胞，重悬后以5×103个/孔接种于96孔板中，每组设置3个复孔，每孔加入200 μL完全培养基，培养24 h后，吸出培养液，PBS洗涤2次，加入不同浓度的氯胍(0、2、4、8、16、32、64、128 μmol/L)处理48 h，每孔加入50 μL 2 g/L MTT溶液，继续培养5 h，吸出培养液，每孔加入150 μL二甲亚砜，置于摇床上避光震荡15 min，使用多功能酶标仪检测490 nm波长处的光密度(OD值)，使用Graphprism绘制MTT曲线，计算IC50。细胞相对活力=实验组OD值/对照组OD组。

1.5 克隆形成实验检测细胞集落形成能力

收集对数期的Hep-G2及SMMC-7721细胞，重悬后以8×103个/孔接种于24孔板中，每组设置3个复孔，每孔加入1 mL完全培养基，培养24 h后，弃上清液，PBS洗涤2次，加入不同浓度的氯胍(0、10、20、40 μmol/L)处理5～7天，待对照组细胞生长至70%左右，弃上清液，PBS洗涤2次，加入4%多聚甲醛固定15～20 min，PBS冲洗2次，每孔加入0.5 mL结晶紫染色30 min，流动水冲洗，烘干，多功能酶标仪检测550 nm波长处的OD值。

1.6 Western blotting检测蛋白表达情况

收集对数期的Hep-G2及SMMC-7721细胞，重悬后以6×105个/孔接种于6孔板中，每孔加入2 mL完全培养基，培养24 h后，弃上清液，PBS洗涤2次，加入不同浓度的氯胍(0、10、20、40 μmol/L)处理12 h，加入细胞裂解液后煮沸10 min，置于4 ℃冰箱保存备用，使用时进行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、剪膜、5%脱脂牛奶封闭1 h、一抗4 ℃孵育过夜、TBST洗涤5～6次、二抗室温孵育2 h、TBST洗涤条带3～4次、加入ECL化学发光液后使用TANON机器进行曝光，使用Image J软件对目标条带进行分析。

1.7 Transwell检测细胞迁移能力

收集对数期的Hep-G2及SMMC-7721细胞，加入无血清DMEM基础培养基重悬，配制成无血清细胞混悬液，取200 μL含4×104个细胞的混悬液接种于小室上层，加入不同浓度的氯胍(0、10、20、40 μmol/L)，小室下层加入600 μL含10%FBS的DMEM培养基，24 h后取出小室，4%多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗2次，每孔加入0.5 mL结晶紫染色2 h，流动水冲洗后拭去小室上层细胞，待小室烘干后在显微镜下拍照，使用Image J进行细胞计数。

1.8 统计学分析

2 结 果

2.1 不同浓度氯胍对SMMC-7721及Hep-G2细胞增殖的影响

MTT结果显示，与氯胍0 μmol/L比较，SMMC-7721、Hep-G2细胞活力随氯胍浓度升高而降低(P<0.05；图1)。SMMC-7721及Hep-G2两种细胞株的IC50分别为50 μmol/L及40 μmol/L。当氯胍浓度为40 μmol/L时，对两种细胞株的抑制效果已经很明显，最终实验选择0～40 μmol/L的氯胍。

图1 不同浓度氯胍对细胞增殖的影响a为P<0.05，与同细胞氯胍0 μmol/L比较。

2.2 不同浓度氯胍抑制Hep-G2及SMMC-7721细胞集落形成能力

与氯胍0 μmol/L组比较，其他氯胍浓度组Hep-G2及SMMC-7721的集落形成能力降低(P<0.05；图2)。

图2 不同浓度氯胍抑制Hep-G2及SMMC-7721细胞集落形成能力1、2、3、4分别为0、10、20、40 μmol/L氯胍组。a为P<0.05，与同细胞氯胍0 μmol/L比较。

2.3 不同浓度氯胍抑制Hep-G2及SMMC-7721细胞迁移

Transwell结果显示，与氯胍0 μmol/L组比较，其他氯胍浓度组对细胞迁移的抑制作用增强(P<0.05；图3)。

图3 不同浓度氯胍抑制Hep-G2及SMMC-7721细胞迁移(结晶紫染色，100×)1、2、3、4分别为0、10、20、40 μmol/L氯胍组。a为P<0.05，与同细胞氯胍0 μmol/L比较。

2.4 不同浓度氯胍抑制FASN、SREBP-1c在Hep-G2及SMMC-7721中的表达

Western blotting结果显示，与氯胍0 μmol/L组比较，氯胍其他浓度组FASN、SREBP-1c在两种肝癌细胞中的表达均降低(P<0.05；图4)。

图4 不同浓度氯胍抑制FASN、SREBP-1c在Hep-G2及SMMC-7721中的表达A为Western blotting实验结果；B为蛋白表达柱状图。1、2、3、4分别为0、10、20、40 μmol/L氯胍组。a为P<0.05，与同细胞氯胍0 μmol/L比较。

3 讨 论

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球常见的癌症。虽然近年来肝癌在治疗上取得了显著进展，但肝癌患者的预后仍然相对较差，特别是那些无法接受手术治疗的晚期肝癌患者。目前对肝癌细胞增殖影响因素已有报道[7-8]，但国内外尚无氯胍对肝癌细胞增殖影响的报道。氯胍是一种双胍类药物，课题组前期研究发现氯胍对膀胱癌细胞增殖具有抑制作用[9]。本研究40 μmol/L的氯胍对Hep-G2、SMMC-7721细胞株的抑制效果明显，所以选择最高浓度40 μmol/L用于实验。通过MTT、克隆形成及迁移实验证实了氯胍对两种肝癌细胞系Hep-G2及SMMC-7721增殖及迁移具有抑制作用，并深入探索其对脂代谢相关蛋白的影响，提示氯胍是一种潜在的抗肝癌药物。

脂质代谢的改变是癌症进展的标志之一。在癌细胞中，脂肪酸的合成主要受转录调控因子SREBP-1的调节[10]。SREBP-1c是SREBP-1的同工型，通过增加其靶基因的转录来激活脂肪酸生物合成途径[11]。从而提供用于膜和信号分子的生物合成的原料。FASN是脂肪酸生物合成途径的关键酶，并在多种癌症中过表达，例如乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、卵巢癌、肺癌和肝癌，但其在癌旁组织中的表达较低，在许多情况下与不良预后密切相关[12]。大多数癌细胞依赖于FASN介导的合成途径，因此FASN是一个良好的治疗靶标。研究表明，FASN的过表达与肝癌的发展密切相关，与肿瘤细胞的生存和迁移密切相关[13-14]。Zhang等[15]研究表明，沉默FASN能够抑制肝癌细胞株Hep-G2增殖。Yu等[16]研究发现，ZHX2通过抑制SREBP-1c介导的新生脂肪生成进而抑制肝癌细胞增殖。因此，抑制FASN/SREBP-1c通路可能是肝癌潜在的治疗靶点，本研究结果显示，氯胍抑制FASN、SREBP-1c的表达。

综上所述，氯胍具有良好的抗肿瘤活性，能抑制肝癌细胞系Hep-G2及SMMC-7721的增殖及迁移。其机制可能是氯胍通过抑制FASN/SREBP-1c通路，从而抑制肝癌细胞增殖。