林惠军， 杨倩， 龚潇

(四川大学华西医院龙泉医院眼科，四川省成都市 610100)

青光眼是致盲的主要原因之一，主要表现为视神经损伤。视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell，RGC)变性和视野丧失是视神经损伤的主要特征，延缓RGC细胞凋亡和提高RGC存活是青光眼治疗的一种潜在有效治疗策略[1-2]。RGC-5是一种被广泛应用于青光眼细胞和分子机制研究的体外系统[3]。野黄芩素是从常用中药黄芩中分离得到的一种天然黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化和抑制肿瘤血管生成等多种生物学功能[4]。野黄芩素能减轻缺氧/复氧导致的RGC损伤，但其具体机制尚不清楚[5]。叉头状转录因子O(forkhead box O，FoxO)是磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/Akt通路的下游靶点，通过磷酸化作用转移到细胞质中，降低其转录活性[6]，FoxO1在细胞凋亡和细胞存活调节中发挥重要作用[7]。而FoxO1蛋白在分离的视网膜中有表达[8]，因此推测Akt介导的FoxO1信号通路可能在RGC凋亡中起作用。本研究检测野黄芩素对RGC-5细胞凋亡的影响，并分析Akt/FoxO1信号通路在整个过程中的作用，为野黄芩素治疗青光眼提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器

野黄芩素和拉坦前列素(美国Sigma公司)；RGC-5细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)；30%H2O2和Hoechst 33258染色液(江苏凯基生物技术股份有限公司)；DMEM低糖培养基和胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；细胞计数试剂盒8(cell count kit 8，CCK-8)(美国Amresco公司)；活性氧(reactive oxygen species,ROS)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)(南京建成生物工程研究所)；RIPA裂解液(北京索莱宝生物技术公司)；Akt、磷酸化-Akt(phosphorylated Akt，p-Akt)、FoxO1、磷酸化-FoxO1(phosphorylated FoxO1，p-FoxO1)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、Caspase-3、GADPH和HRP标记山羊抗鼠二抗(美国Santa Cruz公司)；荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)；Sunrise型全自动酶标仪(瑞士Tecan公司)；BD垂直电泳仪(美国BD公司)。

1.2 细胞培养和分组

常规细胞培养条件下用含10%胎牛血清的DMEM低糖培养基培养RGC-5细胞至融合70%左右。实验分为阴性对照组、模型组、低野黄芩素组、高野黄芩素组和阳性对照组。阴性对照组不处理，其他组加入终浓度200 μmol/L H2O2构建RGC氧化应激损伤模型[9]；同时，低野黄芩素组和高野黄芩素组分别给与终浓度25和100 μmol/L野黄芩素[10]，阳性对照组给与终浓度25 μmol/L拉坦前列素[11]。将RGC-5细胞接种于不同孔板中培养，待细胞贴壁后按每组因素干预24 h后进行相关检测。

1.3 细胞增殖率的检测

将细胞接种于96孔板(5×103个/孔)培养后，加入CCK-8(10 μL/孔)，继续培养4 h，用酶标仪测定光密度(OD)，细胞增殖率(%)=(实验组OD-空白孔OD)/(阴性对照组OD-空白孔OD)×100%。

1.4 细胞凋亡率的检测

将细胞接种于6孔板(1×106个/孔)培养后，加入2 mL磷酸盐缓冲液洗涤1次，4%多聚甲醛固定10 min，加入Hoechst 33258染色液，染色10 min后于荧光显微镜下计数凋亡阳性细胞。凋亡细胞的核呈明亮的凝结和碎裂，而非凋亡的细胞核染色质呈浅蓝色，结构有序。细胞凋亡率(%)=凋亡阳性细胞数/总细胞数×100%，5个不同视野范围内计数超过500个细胞。

1.5 ROS和SOD的检测

将细胞接种于6孔板(1×106个/孔)培养后，加入2 mL磷酸盐缓冲液洗涤，细胞超声破碎仪处理30 s，离心取上清，按试剂盒说明书检测细胞ROS和SOD水平。

1.6 凋亡相关蛋白水平的检测

将细胞接种于6孔板(1×106个/孔)培养后，加入2 mL磷酸盐缓冲液洗涤，离心弃上清，加入RIPA裂解液(100 μL)裂解2 h，离心取上清，加入1/5体积5×Buffer，在沸水中变性，进行电泳(20 μg/孔)，切胶后进行转膜，然后用5%脱脂牛奶在室温下封膜1 h，将膜与Akt(1∶200)、p-Akt(1∶400)、FoxO1(1∶400)、p-FoxO1(1∶500)、Bcl-2(1∶300)、Bax(1∶400)和Caspase-3(1∶200)进行孵育(4 ℃过夜)，磷酸盐缓冲液洗涤1次，将膜与HRP标记山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)在室温下孵育30 min，显色，采集图像进行分析(以GADPH为内对照)。

1.7 统计分析

2 结 果2.1 野黄芩素对RGC-5细胞增殖和凋亡的影响

与阴性对照组比较，其他组细胞增殖率降低，细胞凋亡率增加(P<0.05)；与模型组比较，野黄芩素组和阳性对照组细胞增殖率增加，细胞凋亡率降低；且随野黄芩素剂量增加差异更为显著，但阳性对照组作用最明显(P<0.05；图1和表1)。

图1 野黄芩素对RGC-5细胞凋亡的影响(箭头所示为凋亡细胞，400×)

表1 野黄芩素对RGC-5细胞增殖和凋亡的影响(n=3) 单位：%

2.2 野黄芩素对ROS和SOD水平的影响

与阴性对照组比较，其他组细胞ROS水平增加，SOD水平降低(P<0.05)；与模型组比较，野黄芩素组和阳性对照组细胞ROS降低，SOD水平增加；且随野黄芩素剂量增加差异更为显著，但阳性对照组作用最明显(P<0.05；表2)。

表2 野黄芩素对RGC-5细胞ROS和SOD水平的影响(n=3)

2.3 野黄芩素对凋亡相关蛋白水平的影响

与阴性对照组比较，其他组细胞p-Akt/Akt、p-FoxO1/FoxO1、Bcl-2水平降低，Bax和Caspase-3水平增加(P<0.05)；与模型组比较，野黄芩素组和阳性对照组细胞p-Akt/Akt、p-FoxO1/FoxO1、Bcl-2水平增加，Bax和Caspase-3水平降低；且随野黄芩素剂量增加差异更为显著，但阳性对照组作用最明显(P<0.05；图2和表3)。

图2 野黄芩素对RGC-5细胞凋亡相关蛋白水平的影响

表3 野黄芩素对RGC-5细胞凋亡相关蛋白水平的影响(n=3)

3 讨 论

RGC-5细胞在包括糖尿病视网膜病变或实验性青光眼在内的任何疾病条件下都很容易受损，导致不可逆性视网膜损伤。一些研究表明，实验性青光眼引起神经元并发症发病机制的关键事件是氧化应激，氧化应激时ROS产生增加，同时过度消耗抗氧化剂(如SOD)，使视网膜受损[12]。棕榈酸诱导的细胞毒性也是通过RGC-5细胞ROS和丙二醛产生增加而引起的，这也证实了上述推测[13]。有研究显示，抗氧化剂野黄芩素在体外对H2O2诱导的视网膜色素上皮细胞具有细胞保护作用，同时，野黄芩素对缺血损伤的RGC细胞和无长突细胞的保护作用也似乎至少与其抗氧化作用有关[14]。本研究结果显示，野黄芩素能降低RGC-5细胞ROS水平，增加SOD水平，发挥抗氧化作用，与上述研究结果相一致。

众所周知，线粒体参与许多代谢反应，通过氧化磷酸化为细胞提供能量，然而，线粒体损伤在ROS产生后立即开始，使线粒体内膜上的线粒体通透性转换孔过度开放，细胞凋亡信号因子从线粒体中流出，导致细胞凋亡[15]。本研究结果显示，野黄芩素能促进RGC-5细胞增殖，抑制细胞凋亡，虽然其作用强度不如青光眼治疗的推荐药物(拉坦前列素)，但作为一种新药的研发，还是有进一步研究的价值。

Akt/FoxO1信号通路是细胞对氧化应激反应的关键细胞级联。越来越多的证据表明，Akt/FoxO1信号通路由ROS驱动[16]。Akt是PI3K/Akt通路下游信号通路中最重要的蛋白之一，是重要的抗凋亡调控因子。FoxO1也被认为是PI3K/Akt信号通路的关键直接效应因子，其核转移会导致细胞凋亡[17]。进一步的研究表明，FoxO1低表达赋予眼睛疾病相对较高的风险，并证实了其在RGC细胞中的表达[18]。乙酰化、磷酸化和泛素化通过改变FoxO1的亚细胞定位来调节其活性。同时，PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002处理后的小鼠胚胎干细胞增殖明显受到抑制，促进细胞凋亡，且呈剂量依赖性和时间依赖性[19]。叶酸缺乏也呈时间依赖性地降低Akt磷酸化水平来抑制FoxO1的转录激活，从而诱导小鼠卵母细胞凋亡[20]。在本研究中，野黄芩素促进了RGC-5细胞Akt和FoxO1磷酸化，并呈剂量依赖性，表明激活Akt/FoxO1信号通路可以抑制RGC-5细胞凋亡。

FoxO1蛋白主要作为转录因子在细胞核中发挥作用，并作为单体与其相关的DNA靶向序列结合调控下游靶点，如Bcl-2、Fas配体、p27、磷酸酶与张力蛋白同源物和细胞周期蛋白等抑制细胞增殖，促进细胞凋亡和细胞周期阻滞[21]。Bcl-2是重要的抗凋亡分子，可通过与促凋亡蛋白(如Bax)相互作用来调控细胞凋亡。Bcl-2启动子中存在两个保守的FoxO1结合位点，Bcl-2启动子的激活需要这两个位点[22]。FoxO1在交感神经细胞和心肌细胞中直接激活Bcl-2基因表达，抑制细胞凋亡[23]。Bcl-2的激活最终能抑制Caspase-3活化及早发挥出抗凋亡作用。在本研究中，野黄芩素促进了RGC-5细胞Bcl-2水平增加，降低Bax和Caspase-3水平，共同调控H2O2诱导的RGC-5细胞凋亡。

综上所述，野黄芩素可抑制RGC-5细胞氧化应激水平，激活Akt/FoxO1信号通路，抑制H2O2诱导的细胞凋亡，促进RGC-5细胞增殖，这一发现为野黄芩素治疗RGC凋亡相关眼病提供了新策略。