田时雨 张蓓林 雷阳 封闻 吕立堂

摘要：生长素反应因子（Auxin response factor）作为调控生长素应答基因表达的转录因子，对调控植物生长发育起着十分重要的作用。研究结合茶树基因组数据，使用生物信息学分析，共鉴定出25个ARF基因，并将其命名为CsARF1～CsARF25。可将它划分入5个亚族，同一亚族内的基序和保守结构域相对保守。通过对CsARF顺势作用元件的分析，发现其可能参与茶树对逆境胁迫的响应和调控茶树的生长发育。通过转录组基因表达情况分析，CsARF在茶树不同组织的表达情况有很大区别，从一定程度上说明了CsARF参与调控茶树的生长发育，qRT-PCR验证分析结果趋势与转录组数据基本一致，也从侧面验证了这一结果。研究结果可为茶树ARF基因家族的进一步研究提供理论依据和参考。

关键词：茶树;ARF基因家族;基因表达分析

Identification and Expression Analysis of

Auxin Response Factor （ARF） Gene Family in

Tea Plants （Camellia sinensis）

TIAN Shiyu1，2， ZHANG Beilin3， LEI Yang1， FENG Wen4， L? Litang2*

1. Guizhou Vocational College of Agriculture， Guiyang 551499， China; 2. College of Tea Science， Guizhou University，

Guiyang 550025， China; 3. Guizhou Polytechnic of Construction， Guiyang 551400， China;

4. Quzhou Lüfeng Industry and Trade Co.， Ltd.， Quzhou 324000， China

Abstract： As a transcription factor that regulates the expression of auxin response genes， auxin response factor （ARF）plays a very important role in regulating plant growth and development. In this study， combining the tea genome data and bioinformatics analysis， a total of 25 ARF genes were identified and named CsARF1-CsARF25 respectively. They could be divided into 5 subfamilies， and the motifs and conserved domains in the same subfamilies are relatively conservative. Through the analysis of the homeopathic elements of CsARFs， it was found that they may participate in the response of tea plants to stresses and regulate the growth and development of tea plants. Through transcriptome gene expression analysis， the expressions of CsARFs in different tissues of tea plants are very different. It also indicates that CsARFs might be involved in regulating the growth and development of tea plants. The trend of qRT-PCR verification and analysis results were basically consistent with the transcriptome data. This study provided acertain theoretical basis and reference for further study of the CsARF gene family.

Keywords： Camellia sinensis， ARF gene family， Gene expression analysis

茶樹（Camellia sinensis L.）作为一种重要的经济作物，在全世界多个国家及地区广泛种植[1]。采摘茶树鲜叶加工而成的茶叶产品具有很高的经济价值。同时，茶叶的内含物质，如茶多酚、茶氨酸和茶多糖等，具有清肠胃、助消化、抗菌[2]、清血管、减脂[3]、降三高[4]和抗氧化[5]等保健功能，因而深受国内外广大消费者喜爱。茶树在生长过程中受到很多因素的影响，植物激素是其重要的调节因素之一，对茶树的生长发育过程起到至关重要的作用。

生长素（Auxin）是植物体内最为常见的激素之一，在植物的生长分化过程中起到关键作用。而生长素反应因子（ARF）作为调控生长素应答基因表达的转录因子，对于茶树的信号转导及生长发育起到非常重要的作用[6]。植物对生长素信号的传递与转导过程中，通常是由生长素反应因子以基因家族的形式来进行调控的，如Aux/IAA和SAUR基因家族，对于调节植物的生长发育起到了非常重要的意义[7]。ARF大多具有3个主要的结构域，即N端DNA结合结构域（DNA binding domain， DBD）、中间区域和C端二聚作用结构域（Carboxy-terminal dimerization domain， CTD）[8]。ARF特异性结合到植物生长素反应基因启动子上的生长素反应元件（Auxin response elements，AuxRE）TGTCTC，从而控制调节生长素反应基因的特异性表达[9]。6082ADD5-E0B6-4BED-A151-861268587491

近年来，随着基因组数据的测定，越来越多植物种类的ARF家族成员被鉴定出来，如拟南芥中ARF家族成员23个[10]、水稻中25个[11]、玉米中31个[12]、苹果中29个[13]、梨中31个[14]、杜仲中18个[15]、莲中30个[16]、烟草中50个[17]、番茄中17个[18]、甜橙中19个[19]等。本研究从茶树的ARF基因家族着手展开，利用生物信息学的相关研究方法和研究软件，对茶树的基因组数据进行比对，找到并鉴定其ARF家族成员，并对其相关特性及通过荧光定量PCR鉴定不同组织的表达情况进行相应的研究，以期为茶树生长发育的相关研究起到一定的参考作用。

1  材料与方法

1.1  茶树ARF基因家族的筛选与鉴定

从茶树数据库（http：//tpia.teaplant.org）中下载茶树ARF基因组相关数据，构建本地数据库。以拟南芥与水稻已经鉴定出的ARF蛋白序列为目标序列，在茶树蛋白库中进行BLAST比对，设定阈值为E

将第二次所得到的茶树ARF蛋白序列在NCBI-CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）进行保守结构域的鉴定，删除部分不含ARF特征结构域的蛋白序列，最终得到茶树ARF基因。在Expasy（https：//web.expasy.org/compute_pi）上鉴定茶树ARF蛋白序列的等电点（PI）和相对分子质量。

1.2  系统进化树、基因结构和蛋白质保守结构域分析

利用进化树分析软件MEGA7对水稻、拟南芥和茶树的ARF蛋白进行比对，继而采用临近法（Boostrap=1 000）进行系统进化树的构建。再将茶树ARF蛋白序列提交至MEME（http：//meme-suite.org）进行保守序列分析，设置为20个模體（motif）数量，模体宽度范围设置为6～50个氨基酸。将茶树ARF基因的DNA序列在GSDS 2.0 （http：//gsds.cbi.pku.edu.cn）进行基因结构分析。

1.3  茶树不同组织ARF的表达分析

根据已鉴定的茶树ARF基因编号，在TPIA（http：//tpia.teaplant.org）数据库上下载它们在茶树不同组织（花、茎、根、顶芽、嫩叶、成熟叶、老叶）的转录组数据（TPM值），对数据进行标准化处理，再利用TBtools构建热图进行可视化。

1.4  茶树ARF基因的亚细胞定位预测

利用模式识别数据库（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/ bioinf/plant-multi）对茶树ARF蛋白进行亚细胞定位预测[20]。

1.5  茶树ARF基因顺势作用元件分析

利用茶树基因组数据库，截取茶树ARF基因上游2 000 bp的基因序列，在PlantCare（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html）中进行顺式作用元件的分析。

1.6   茶树ARF家族基因的qRT-PCR表达分析

取茶树嫩叶、老叶和茎提取总RNA，使用改良CTAB法提取RNA，使用Genenode公司的反转录试剂盒进行cDNA的合成操作，以茶树肌动蛋白基因为内参基因（Sense ： 5'-CAGACCGTATGAGCAAGGAAAT-3'，Antisense：5'-GTGCTTAGGGATGCAAGGATAG-3'），采用Primer Premier v6.0软件设计候选基因特异性引物（表1），qRT-PCR实验在CFX100 Realtime PCR System（Bio-Rad，CA，USA）上进行。反应条件为95 ℃30 s、95 ℃15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40次循环，溶解温度55～95 ℃，5 s，4 ℃保存。反应体系按照SYBR Green Realtime-PCR Mastermix说明书进行，结果通过相对定量2-ΔΔCT方法计算，最后利用Excel作图。

2  结果与分析

2.1  茶树CsARF基因家族鉴定及其理化性质

根据拟南芥ARF蛋白序列，在茶树基因组蛋白序列中通过2次BLAST比对后，再通过保守结构域的筛选，去除部分不含ARF特征结构域的蛋白序列，共得到25个茶树ARF基因。

为便于后续研究，以CsARF1-25对茶树ARF基因进行命名。CsARF基因编码蛋白质理化性质如表2。由表2可知茶树CsARF蛋白中最长为1 077个氨基酸（CsARF15），最短为353个氨基酸（CsARF7），相对分子质量在39 444.98（CsARF7）至120 236.32（CsARF14）之间。较为有趣的一点是，CsARF蛋白的等电点大多小于7，可知组成CsARF蛋白的氨基酸多为酸性氨基酸。对CsARF蛋白进行亚细胞定位预测的结果可以看出，所有的CsARF蛋白都定位在细胞核内，这与其作为转录因子的功能相符合。

2.2  CsARF系统进化分析

将拟南芥ARF基因家族25个成员、水稻ARF基因家族25个成员与茶树ARF基因家族的25个成员进行多序列比对，并利用临近法（NJ）构建系统发育进化树（图1）。由图1可得，根据拟南芥ARF基因家族的划分，可将茶树25个ARF分为5个亚组。其中8个CsARF基因分入Ⅰ亚组（CsARF2、CsARF6、CsARF9、CsARF14、CsARF15、CsARF17、CsARF22和CsARF25）;3个CsARF基因划入Ⅱ亚组（CsARF11、CsARF18和CsARF16）;8个CsARF基因划入Ⅲ亚组（CsARF4、CsARF5、CsARF8、CsARF12、CsARF19、CsARF21、CsARF23和CsARF24）;1个CsARF基因划入Ⅳ亚组（CsARF3）;5个CsARF基因划入Ⅴ亚组（CsARF1、CsARF7、CsARF10、CsARF13和CsARF20）。6082ADD5-E0B6-4BED-A151-861268587491

从系统进化树中不难发现，茶树ARF基因与拟南芥ARF基因同源性较高，而与水稻ARF基因则相对疏远，暗示了茶树与拟南芥ARF基因的进化时间要晚于茶树与拟南芥的物种分化时间，而茶树与水稻的情况则相反。

2.3  CsARF基因的染色体定位

利用茶树基因组的注释信息，可将CsARF基因定位在茶树染色体上（图2）。从图2可知，CsARF在茶树染色体上的定位并不均匀，其中7个CsARF基因不能定位在染色体上（CsARF3、CsARF5、CsARF6、CsARF7、CsARF13、CsARF22和CsARF25）。其余的18个CsARF基因不均等定位在各个茶树染色上，其中3号、5号、9号和15号染色体上没有CsARF基因，8号染色体上最多共有3个CsARF基因（CsARF2、CsARF17和CsARF16），其他染色体上均有1～2个CsARF基因。这种分布情况的出现有可能是源自CsARF基因在茶树的进化过程中发生了复制或丢失。

2.4  CsARF基因保守结构域分析

利用NCBI-CDD和MEME分析CsARF蛋白保守结构域如图3，可以看出同一亚组之中，保守结构域的组成和排序基本相同，其中Ⅳ亚组中没有3号模体，而其他亚组中的第一个保守结构域均为3号模体，暗示了Ⅳ亚组的CsARF基因在进化过程中可能出现了部分丢失的情况。各个亚组之中的CsARF蛋白的保守结构域也基本一致，大部分CsARF都含有3个保守结构域（DBD、ARF和CTD），其中较为有趣的是Ⅴ亚组之中的CsARF7，作为唯一个不含ARF结构域的CsARF基因，经对比可以发现其结构域7后所连为结构域8，其间缺少了部分重要结构域，因而它不含ARF保守结构域，暗示它可能在茶树进化过程中基因片段发生了部分丢失。

2.5  CsARF基因结构分析

根据茶树基因组注释信息，可得CsARF基因的基本结构（图4）。从图4中可以发现所有的CsARF都具有2个以上的外显子;其中同一亚组之中的基因结构也基本一致，Ⅲ亚组的外显子数目最少，只有2～3个;其他亚组的外显子数目则相对较多，最多为17个。

2.6  CsARF基因顺式作用元件的分析

取CsARF基因上游2 000 bp的启动子区域序列，在PlantCare对其进行分析预测，结果如表3。所有的CsARF基因都具有光相应元件，说明CsARF基因家族与茶树响应光照方面具有很大联系。绝大部分CsARF基因都具有响应各种植物激素的作用，如赤霉素、乙烯、生长素和水杨酸，证明了其在调控茶树生长发育方面起到了重要的作用。而且部分CsARF基因还具有响应茶树生长逆境如干旱、寒冷和盐胁迫的顺式作用元件。暗示了CsARF基因可能不止与调控茶树生长发育有关，可能在茶树抗逆性上也起到了一定的作用。

2.7  CsARF基因在不同组织中的表达情况分析

为进一步了解CsARF在茶树不同组织的表达情况，从TPIA上下载了茶树不同组织转录组的TPM表达数据，对数据进行标准化处理，并对其结果构建热图进行分析研究，结果如图5。CsARF3、CsARF19、CsARF23、CsARF12和CsARF24在茶树各个组织中几乎不表达。而CsARF2、CsARF6、CsARF7、CsARF17、CsARF13和CsARF10则在茶树各个组织之中的表达量相对较高。CsARF15、CsARF14、CsARF9、CsARF22和CsARF1则在各组织之中有较弱表达。其中CsARF2、CsARF6和CsARF17（属Ⅰ亚组）在茎与花中表达量最高，其他组织中的表达相对较低，而CsARF10和CsARF13（属Ⅴ亚组）则在成熟叶、老叶、嫩叶和果实中表达量最高。这种不同的表达趋势，可能暗示了不同亚组的CsARF基因可能参与了茶树不同生长阶段的表达。

2.8  RT-PCR验证CsARF基因在茶树不同组织的表达情况

根据CsARF的转录组情况，筛选出7个有显著性差异的CsARF基因，分别为CsARF2、CsARF6、CsARF17、CsARF9、CsARF22、CsARF20和CsARF10。

对其进行不同组织的RT-PCR验证，结果如图6所示，CsARF基因在各组织的表达情况与茶树转录组测序结果具有一定差异，但其趋势基本保持一致。

3  讨论

通过对茶树全基因组的生物信息分析，共鉴定出25个CsARF基因，不同物种的ARF基因数量差距很大，如在大豆中有51个ARF基因[21]，而茶树与水稻中则只有25个[11]。与苹果[13]和杜仲[15]一致，绝大部分CsARF蛋白等電点（PI）都小于7，属酸性蛋白。作为转录因子CsARF蛋白定位预测全部都位于细胞核，这与其他物种情况不同，如烟草的ARF定位就有部分定位于叶绿体和线粒体[17]。与拟南芥亚族的划分一样，可将CsARF划分入5个亚族之中[10]，其中Ⅰ亚组和Ⅲ亚族基因数量最多，均有8个，Ⅳ亚族最少，仅有1个。通过分析结构域和保守结构域发现，大多数CsARF具有3个结构域（DBD、ARF和CTD），3号模体结构域可以与DNA结合[22]，进而与生长素反应基因启动子上的作用元件结合，其Auxin_resp结构域通过与生长素的结合调节相关基因的表达[8]。而通过对结构域的研究不难发现，不同亚族中的模体种类和数量基本一致，不同亚族之间则差距较大，这可能是茶树在进化过程中部分基因发生了丢失和保留。25个CsARF基因共存在7个基因对，说明茶树在进化过程中发生了不同染色体之间的复制[23]。对基因结构的分析可以使得物种的进化关系更为明确[24]，通过对CsARF基因结构的分析，可知CsARF基因由2～17个外显子构成，虽然不同亚族之间的外显子个数变化较大，但其与其他物种的ARF基因外显子数量范围基本一致，如苹果[13]、水稻[11]、番茄[25]等，说明ARF在物种的进化过程中相对保守。通过对CsARF基因的顺式作用元件的分析发现，其对于调控茶树生长发育和响应逆境环境也可能起到一定的作用。ARF基因对于植物的生长发育有着至关重要的作用[26]，通过对茶树不同组织的CsARF基因的表达量研究发现，不同亚族的表达量不尽相同，有些在花和茎中表达量高（CsARF2、CsARF6和CsARF17），有些则在叶片中表达量较高（CsARF10和CsARF13）。筛选出其中表达量较高的7个基因，RT-PCR验证结果与转录组测序结果基本一致。其他物种的ARF基因在不同器官的表达情况也有所区别，如拟南芥AtARF1在花中表达量最高[27]，AtARF12在果实中表达量最高[10]，AtARF19则在新叶和根中表达量最高[28]，这种不同亚族的表达量的差别原因及表达意义也是下一步的重点研究方向。6082ADD5-E0B6-4BED-A151-861268587491

参考文献

[1] LIU Y， WANG D Z， ZHANG S Z， et al. Global expansion strategy of Chinese herbal tea beverage[J]. Advance Journal of Food Science and Technology， 2015， 7（9）： 739-745.

[2] 文杰宇， 李宗军， 王远亮， 等. 黑茶中微生物及其相关保健功能研究进展[J]. 食品科学， 2010， 31（9）： 329-332.

[3] QIN L， LIU Z， HUANG J， et al. Anti-obesity and hypolipidemic effects of Fuzhuan brick tea water extract in high-fat diet-induced obese rats[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture， 2013， 93（6）： 1310-1316.

[4] LIAN M， JIANG Y F， LV S D， et al. The anti-obesity effect of instant Pu-erh black tea in mice with hydrogenated oil diet-induced obesity[J]. Applied Mechanics & Materials， 2014， 644-650： 5248-5251.

[5] CHENG Q， CAI S， NI D， et al. In vitro antioxidant and pancreatic α-amylase inhibitory activity of isolated fractions from water extract of Qingzhuan tea[J]. Journal of Food Science & Technology， 2015， 52（2）： 928-935.

[6] 蒋素梅， 陶均， 李玲. 早期生长素响应蛋白在生长素信号转导中的作用[J]. 植物生理学通讯， 2005（1）： 125-130.

[7] 胡晓， 侯旭， 袁雪， 等. ARF和Aux/IAA调控果实发育成熟机制研究进展[J]. 生物技术通报， 2017， 33（12）： 37-44.

[8] CHANDLE R， WILLIAM J. Auxin response factors[J]. Plant Cell & Environment， 2016， 39（5）： 1014-1028.

[9] GUILFOYLE T  J. The PB1 domain in auxin response factor and Aux/IAA proteins： A versatile protein interaction module in the auxin response[J]. Plant Cell， 2015， 27（1）： 33-43.

[10] OKUSHIMA Y， OVERVOORDE P J， ARIMA K， et al. Functional genomic analysis of the auxin response factor gene family members in Arabidopsis thaliana： Unique and overlapping functions of ARF7 and ARF19[J]. The Plant Cell， 2005， 17（2）： 444-463.

[11] WANG D ， PEI K， FU Y， et al. Genome-wide analysis of the auxin response factors （ARF） gene family in rice[J]. Gene， 2007， 394（1/2）：13-24.

[12] XING H， PUDAKE R N， GUO G， et al. Genome-wide identification and expression profiling of auxin response factor （ARF） gene family in maize[J]. BMC Genomics， 2011， 12（1）：178. https：//doi.org/10.186/1471-2164-12-178.

[13] 李慧峰， 冉昆， 何平， 等. 苹果生长素响应因子（ARF）基因家族全基因组鉴定及表达分析[J]. 植物生理学报， 2015， 51（7）： 1045-1054.

[14] 欧春青， 姜淑苓， 王斐， 等. 梨全基因组生长素反应因子（ARF）基因家族鉴定及表达分析[J].中国农业科学， 2018， 51（2）： 327-340.

[15] 刘闵豪， 李龙， 叶靖， 等. 杜仲ARF基因家族全基因组鉴定和表达分析[J]. 林业科学， 2021， 57（3）： 170-180.

[16] 苏静， 王柯阳， 董臣， 等. 莲ARF基因家族全基因组鉴定和表达分析[J]. 南方农机， 2020， 51（15）： 9-13.

[17] 孙亭亭， 张磊， 陈乐， 等. 普通烟草ARF基因家族序列的鉴定与表达分析[J]. 植物遗传资源学报， 2016， 17（1）： 162-168.

[18] KUMAR R， TYAGI A K， SHARMA A K. Genome-wide analysis of auxin response factor （ARF） gene family from tomato and analysis of their role in flower and fruit development[J]. Molecular Genetics and Genomics， 2011， 285（3）： 245-260.

[19]  LI S B， OUYANG W Z， HOU X J， et al. Genome-wide identification， isolation and expression analysis of auxin response factor （ARF） gene family in sweet orange （Citrus sinensis）[J]. Front Plant Sci， 2015， 6： 119-127.

[20] CHOU K C， SHEN H B. Plant-mPLoc： A top-down strategy to augment the power for predicting plant protein subcellular localization[J]. PLoS One， 2010， 5（6）： e11335. https：//doi.org/10.1371/journal. pone.0011335.

[21] CHIEN V H， DUNG T L， RIE N， et al. The auxin response factor transcription factor family in soybean： Genome-wide identification and expression analyses during development and water stress[J]. DNA Research， 2013， 20（5）： 511-524.

[22] SUZUKI M， MCCARTY K. The conserved B3 domain of VIVIPAROUS1 has a cooperative DNA binding activity[J]. Plant Cell， 1997， 9（5）： 799-807.

[23] 江海洋， 魏巍， 劉艳， 等. 高粱生长素反应因子（ARF）基因的全基因组分析与进化研究[J]. 安徽农业大学学报， 2010， 37（3） ：395-400.6082ADD5-E0B6-4BED-A151-861268587491