周筱慧 李笑妍 褚海辰 董铭心

(1 青岛大学附属医院麻醉科，山东 青岛 266003； 2 青岛大学药学院)

吗啡作为经典的阿片类药物在临床上应用广泛，是临床最有效的镇痛药物之一[1-2]。伴随着吗啡的长期应用，受体脱敏、药物耐受等副作用逐渐显现，明显降低了吗啡的镇痛效果，限制了其临床应用[3]。阿片耐受和痛觉过敏的机制复杂，其中μ阿片受体(MOR)信号通路是关键环节[4]。既往研究发现，MOR羧基端存在诸多与吗啡镇痛活性及副作用相关的磷酸化位点。羧基端多位点磷酸化是促使MOR急性脱敏和长期耐受的关键因素，磷酸化位点缺失的MOR可增强阿片类药物镇痛作用[5]。基于此，本研究针对MOR羧基端关键磷酸化区域375STANT379，设计合成多肽，并通过竞争性干扰MOR羧基端关键位点磷酸化，探究受体375STANT379位点磷酸化对吗啡镇痛效果的影响，以期为开发可与吗啡联合应用以增强镇痛作用的多肽类药物提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

MOR质粒由上海联慧脑智工程研究中心提供。HEK-293细胞购于北京中科质检生物技术有限公司。CCK-8试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司。8周龄成年雌性C57BL/6JNifdc小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，所有小鼠先置于12 h/12 h昼夜环境中，温度稳定在(23±2)℃，相对湿度60%，自由进食和饮水，7 d后进行后续实验。

1.2 实验方法

1.2.1多肽的设计 通过GenBank数据库检索并同时确认MOR的完整序列。针对关键磷酸化区域375STANT379氨基酸序列，设计多肽TAT-Q368-T379。为完整囊括关键磷酸化位点，多肽活性部分设计覆盖MOR羧基末端368～379氨基酸序列(QNTREHPSTANT)；为使多肽能穿透多个生物膜进入细胞内发挥预期功效，多肽N端添加穿膜序列TAT(YGRKKRRQRRR)协助功能序列穿膜。

1.2.2多肽固相合成 采用标准多肽固相合成方法，将Fmoc保护氨基酸在Rink amide-MBHA Resin树脂上逐步偶联合成多肽。使用高效液相色谱(HPLC)在Posotisil C18半制备柱上对多肽进行纯化，流动相条件设置为：水相为去离子水+体积分数0.000 5的三氟乙酸，有机相为乙腈+体积分数为0.000 5的三氟乙酸。采用HPLC检测多肽纯度，高分辨质谱法(HRMS-ESI)检测多肽的相对分子质量，验证无误以后，将多肽冻干，置于-20 ℃条件下保存备用。

1.2.3细胞培养与转染 HEK293细胞在含体积分数0.10胎牛血清(FBS)和体积分数0.01抗生素(100 000 U/L青霉素和100 μg链霉素)的DMEM培养基中培养，置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱中培养，隔天传代。应用阳离子聚合物类转染试剂sinofection将含有血凝素标记的MOR质粒(HA-MOR)转染进入细胞。24 h后进行后续实验。

1.2.4CCK-8法检测多肽对细胞的毒性作用 将转染完成的HEK-293细胞接种在96孔板中，每孔104个细胞，待24 h后细胞贴壁后，将细胞随机分为A、B、C、D、E、F组，分别加入终浓度为0、0.5、1.0、10.0、50.0、100.0 μmol/L的多肽100 μL，孵育24 h后，每孔再加入10 μL CCK-8溶液继续培养1 h。使用酶标仪测量波长450 nm处反应体系的吸光度。细胞存活率=[(实验孔吸光度-空白孔吸光度)/(对照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100%。每组设置6个复孔，结果取均值。

1.2.5热板法检测吗啡镇痛效果 将小鼠随机分为A～F组，实验前先测量小鼠体质量和基础痛阈。C组小鼠右下腹腹腔注射5 mg/kg的TAT-Q368-T379，D、E、F组小鼠右下腹腹腔分别注射1、5、10 mg/kg的TAT-Q368-T379，自由活动1 h后，B、D、E、F组小鼠颈背部皮下注射吗啡10 mg/kg，A组小鼠颈背部皮下注射生理盐水10 mL/kg。各组小鼠分别于末次注射后15、30、45、60、90、120、150、180 min采用热板法测定疼痛反应潜伏期，具体方法为：热板仪保持(55±1)℃恒温，将小鼠站立于热板上，以小鼠接触热板到出现舔后足疼痛反应的时间记为疼痛反应潜伏期，作为痛阈指标。以5～30 s为筛选的阈值，以60 s为最大阈值，即小鼠60 s未出现疼痛反应即停止测量。计算吗啡镇痛反应率(MPE)，MPE=[(疼痛反应潜伏期-基础痛阈)/(60-基础痛阈)]×100%。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 TAT-Q368-T379多肽的设计与合成

A：结构式，B：HPLC测定结果，C：HRMS-ESI测定结果

2.2 多肽TAT-Q368-T379的细胞毒性检测结果

CCK-8实验结果显示，A～F组的HEK-293细胞的存活率分别为(96.20±2.49)%、(102.03±4.07%)、(107.21±0.84)%、(106.63±7.53)%、(104.42±10.15)%、(100.02±16.49)%。Welch方差分析结果显示，各组间细胞存活率比较差异无显著性(P>0.05)。

2.3 多肽TAT-Q368-T379对吗啡镇痛效果影响

表1 GEE参数估计结果Tab.1 Parameter estimation results of GEE

当矫正组别效应与交互作用后，默认180 min(time=8)为参照组时，15 min(time=1)、30 min(time=2)、45 min(time=3)、60 min(time=4)、90 min(time=5)、120 min(time=6)、150 min(time=7)MPE的平均水平分别较180 min组高33.478%、59.299%、59.299%、59.299%、57.111%、50.928%、33.979%，差异均有统计学意义(Waldχ2=10.146～84.246，P<0.05),提示矫正不同干预措施的影响，不同时间小鼠MPE值不同。为进一步探究不同干预措施在不同时间对MPE影响的差异，进行简单效应分析，P<0.05时差异具有统计学意义。简单效应分析结果显示，在给药后60～180 min内，D、E、F组小鼠MPE值下降速度较B组明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。C组小鼠在给药后MPE始终维持低水平，与A组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同处理因素对吗啡镇痛效果的影响(χ/%)Tab.2 Effect of different treatment factors on the analgesic effect of morphine (χ/%)

3 讨 论

吗啡是临床上治疗各种急慢性疼痛的常用药物，而伴随吗啡的长期应用，一系列副作用逐渐显现，患者表现为受体脱敏、药物耐受、药物依赖、呼吸抑制、便秘等[6]。MOR是一种抑制性G蛋白偶联受体，当吗啡与MOR结合后，一方面通过G蛋白通路，抑制腺苷酸环化酶和cAMP的产生，降低电压门控Ca2+通道电导，或打开内向整流K+通道，产生镇痛活性[7]。另一方面各种激酶促使MOR磷酸化，招募下游Arrestin蛋白与受体结合，阻止G蛋白偶联导致受体脱敏，同时促进受体内化。去磷酸化受体一部分进入循环返回质膜恢复活性，一部分进入溶酶体进行降解[8]。受体在细胞膜上表达降低可促进药物耐受，降低镇痛效率，因此，MOR磷酸化与吗啡镇痛效果存在密切关系。

MOR羧基末端具有多个丝氨酸、酪氨酸和苏氨酸磷酸化位点[9]，各位点激活方式不同，而且在MOR激活后也会引起不同的生物学效应。LAU等[10]通过定量质谱联合细胞生物学分析方法发现，375STANT379位点是阿片类药物诱导MOR磷酸化的关键位点。阿片类药物作用于MOR以后，介导Ser375位点发生快速且显著的磷酸化，并随后促进其他位点的磷酸化，其中包括Thr370、Thr379和Thr376[11-14]；DOLL等[15]开发的Ser375磷酸化抗体，进一步验证了该位点磷酸化的重要作用。同时375STANT379位点磷酸化与β-arrestin-2蛋白招募及MOR内吞密切相关[10]。将375STANT379序列中所有丝氨酸(S)、苏氨酸(T)突变为丙氨酸(A)以后，β-arrestin-2蛋白招募与MOR内吞受到明显抑制[14，16-17]。研究显示，即使是375STANT379序列中单一位点的突变，也会显著降低与β-arrestin-2蛋白招募相关的受体内吞[10]。受体内吞在受体脱敏及药物耐受中起着关键作用[8，18]。以上生物学效应均在不同程度上对吗啡镇痛效果产生影响，为MOR羧基端375STANT379位点磷酸化与吗啡镇痛效果的关系的研究提供了线索。

由于位点敲除等手段在实际应用上存在困难，因此可以考虑通过药物联用改善吗啡镇痛效果。研究发现，目前有7 000多种天然多肽在人类生理中起到重要作用，并在机体内扮演着激素、神经递质、生长因子、离子通道配体或抗感染药物等角色[19-22]。同时，由于多肽药物具有免疫原性低、组织渗透性好、易于合成和改造、安全性高、不易在组织中蓄积等优点，在抗肿瘤、抗菌及慢性代谢性疾病、心血管疾病、免疫疾病等的治疗中应用广泛[23]，是临床常用的联用药物选择。

本研究针对375STANT379关键磷酸化位点序列设计多肽TAT-Q368-T379，在多肽N端添加穿膜序列TAT，协助多肽穿膜抵达细胞内发挥生物学效应。应用标准固相合成方法合成多肽TAT-Q368-T379，操作简便，且该多肽易于分离纯化、损失小、收率高。HRMS-ESI结果显示，多肽相对分子质量与预期值相符，HPLC结果显示多肽纯度大于96%，提示该多肽合成正确，可以应用于细胞与动物实验。采用CCK-8法检测出的多肽细胞毒性，经Welch方差分析法分析显示各组间差异无统计学意义，提示TAT-Q368-T379安全范围较大，不易产生细胞毒性。小鼠热板实验结果显示，多肽预处理组小鼠吗啡镇痛作用时间较吗啡组小鼠明显延长，而单纯多肽组小鼠未见明显镇痛作用，提示该多肽与吗啡联用可显著延长吗啡持续作用时间，增强了吗啡镇痛效果。结合既往研究结果进行分析，可以推测多肽进入细胞后通过竞争性抑制MOR磷酸化，阻止了β-arrestin-2蛋白募集及MOR内吞过程，抑制了受体脱敏及耐受等一系列副作用的产生，从而改善了吗啡镇痛效果。此机制尚可进一步应用β-arrestin-2蛋白募集实验及受体内吞实验进行验证，同时可将多肽设计思路应用于其他关键位点作用的研究。

综上所述，MOR羧基端375STANT379磷酸化区域与吗啡镇痛相关，本研究设计的多肽可作为工具竞争性抑制此关键位点磷酸化，从而有效增强吗啡镇痛效果。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

伦理批准和动物权利声明：本研究涉及的所有动物实验均已通过青岛大学医学部伦理委员会的审核批准(文件号202007C57162202-111027)。所有实验过程均遵照《实验动物管理条例》的要求进行。

EthicsApprovalandAnimalRight： All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of Qingdao University Faculty of Medicine (Approval Letter No.202007C57162202-111027), and all experimental animal protocols were carried out by following the Animal Management Regulations.

作者贡献：褚海辰、董铭心、周筱慧参与了研究设计；董铭心、周筱慧、李笑妍参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。

Contributions： The study was designed byCHUHaichen,DONGMingxin, andZHOUXiaohui. The manuscript was drafted and revised byDONGMingxin,ZHOUXiaohui, andLIXiaoyan. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.