刘超 魏计超 莫志洋 赵亚平 高慧 赵爱群 李燕 李素芬 孙鹏飞

(1 石家庄市人民医院整形美容中心，河北 石家庄 050000； 2 河北医科大学第三医院药剂科；3 青海省人民医院整形外科； 4 石家庄市人民医院手术室； 5 中国医学科学院整形外科医院整形七科)

自体脂肪作为一种理想的软组织填充材料，其不仅可修复因先天畸形、后天创伤或肿瘤术后导致的软组织缺损，还可对软组织凹陷和面部年轻化患者进行填充塑形。但自体脂肪的吸收率比较高，制约了其在临床应用推广[1]。自体脂肪移植后，在毛细血管再生以前，脂肪无法获得氧气和营养，脂肪细胞容易液化坏死，从而被机体吸收代谢，无法达到脂肪填充的理想效果[2]。因此，如何有效提高脂肪细胞移植后的存活率是整形外科领域研究的热点。另外，在自体脂肪移植中，许多体型较瘦的患者因受到自体脂肪量少的限制，无法达到取材的目的而影响治疗。因此本研究团队一直在寻找一种用组织工程脂肪提高自体脂肪移植存活率的方法。

间充质干细胞(MSCs)可以分化为多种细胞，如脂肪细胞、软骨细胞等，在再生医学以及组织工程学中是公认的新型种子细胞。其中，人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的分化能力更强[3]。本实验将具有多向分化潜能的hUC-MSCs作为种子细胞，诱导其分化为组织工程脂肪，探讨其在脂肪移植中提高脂肪存活率的能力，为组织工程脂肪应用于整形外科临床奠定理论基础。

1 材料及方法

1.1 材料来源

BALB/c雄性裸鼠30只(北京华阜康生物科技有限公司)，6～8周龄，体质量(25±2)g。SD雄性大鼠 10只(河北医科大学动物实验中心)，8～10周龄，体质量(200±10)g。DMEM/F12(1∶1)培养基(美国HyClone 公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，青霉素-链霉素混合液(美国Gibco公司)。

1.2 hUC-MSCs的获取、培养、鉴定及成脂诱导

无菌条件下获取石家庄市人民医院妇产科足月妊娠分娩新生儿脐带标本，1～3 h内在无菌条件下处理，首先将脐带剪成约4 cm长组织段，去除脐静脉和脐动脉，将脐带中华通胶组织撕裂成条索状，剪成体积约1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，向90 mL DMEM/F12(1∶1)培养基中加入含体积分数0.10胎牛血清10 mL及5 000 kU/L的青霉素-链霉素混合液1 mL，均匀混合成培养液。将脐带组织块置入培养液中，于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的饱和湿度孵育箱内培养，7 d后首次换液，以后每3 d换液一次，待细胞融合度约80%时，以2.5 g/L的胰酶消化液消化，按1∶3比例进行传代培养。采用流式细胞术检测培养至第4代时hUC-MSCs表面抗原CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD105的表达。然后应用含有1.0×10-6mol/L地塞米松、10 mg/L胰岛素、0.5 mmol/L 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、0.2 mmol/L吲哚美辛的诱导基对第4代hUC-MSCs进行成脂诱导。每3 d换液一次，24 d后进行油红O脂肪染色鉴定诱导情况。

1.3 脂肪颗粒制备

10只SD大鼠均使用脱椎方式处死，将大鼠肠系膜、腹股沟处的脂肪取出，使用PBS液冲洗3次后，将其剪成体积约为0.5 mm×1 mm ×1 mm～1 mm×1 mm×1 mm大小颗粒，用50 mL离心管装入脂肪颗粒并混合10 mL DMEM/F12培养基，使用离心机对脂肪颗粒进行离心(1 200 r/min)，时间为3 min，将上层的脂肪颗粒取出备用。

1.4 动物模型制备

采用随机数字表法将30只裸鼠分为7 d组、14 d组和28 d组，每组10只裸鼠。每组裸鼠均采用同体对照法，左侧为实验侧，右侧为对照侧。使用1 mL注射器将成脂诱导24 d后的第4代hUC-MSCs 40 mg与大鼠脂肪颗粒360 mg均匀混合后注射至裸鼠左侧(实验侧)腹部筋膜下，并将相同剂量的单纯大鼠脂肪颗粒注射至裸鼠右侧(对照侧)腹部筋膜下。

1.5 移植脂肪组织病理学观察及质量维持率测定

分别于第7、14、28天将3组裸鼠脱椎处死，使用眼科剪刀从裸鼠腹部筋膜下取出全部脂肪组织，使用电子天平称质量后进行病理切片制备及HE染色，对3组裸鼠实验侧与对照侧脂肪组织结构、细胞形态以及微血管含量等进行观察比较。计算各组裸鼠移植脂肪组织质量维持率并行比较，移植脂肪组织质量维持率=(取出总脂肪组织质量/400 mg)×100%。

1.6 统计学分析

2 结 果

2.1 hUC-MSCs流式细胞学检测及成脂诱导结果

对第4代hUC-MSCs采用流式细胞学检测显示，细胞表面抗原CD29、CD44、CD105表达阳性率均在90%以上，CD14、CD34、CD45几乎不表达，符合间充质细胞特性，鉴定第4代hUC-MSCs为纯化的hUC-MSCs细胞。

hUC-MSCs加入成脂诱导基3～5 d后，hUC-MSCs细胞由梭形或多角形逐渐变得圆钝(图1A)。6～8 d后细胞呈圆梭形，细胞的胞浆内形成脂滴，细胞内脂滴逐渐融合变大，诱导23 d后镜下观可以明显看到脂滴相互融合(图1B)。诱导24 d经油红O脂肪染色，细胞内可见大量被染成红色的透亮的脂滴(图1C)。由此可以判断hUC-MSCs转化成了脂肪细胞。

A：hUC-MSCs加入成脂诱导基3 d后的形态，B：hUC-MSCs加入成脂诱导基23 d后的形态，C：hUC-MSCs加入成脂诱导基24 d后进行油红O染色的形态图1 hUC-MSCs成脂诱导后镜下观(200倍)Fig.1 Morphological changes of hUC-MSCs after adipogenic induction under a microscope (200×)

2.2 3组裸鼠移植脂肪组织HE染色结果比较

7 d组对照侧脂肪组织内部有炎性细胞，可见组织坏死和空泡形成。另外，脂肪组织外侧有纤维组织形成(图2A)。14 d组对照侧脂肪组织内部坏死组织明确，脂肪组织切片呈网格状(图2B)。28 d组对照侧脂肪组织中可见明显坏死区，新生血管数目少(图2C)；3组实验侧脂肪组织结构正常，新生血管明显增多，脂肪组织炎症不明显(图2D～F)。

A～C：7、14、28 d组裸鼠对照侧移植脂肪组织HE染色结果，D～F：7、14、28 d组裸鼠实验侧移植脂肪组织HE染色结果

2.3 3组裸鼠移植脂肪组织质量维持率比较

7、14、28 d组实验侧移植脂肪组织质量维持率分别为(99.81±1.36)%、(95.20±1.83)%、(90.64±2.37)%。 7、14、28 d组对照侧则分别为(71.26±5.85)%、(59.14±2.32)%、(50.59±1.94)%。重复测量设计的方差分析结果显示，时间、侧别以及时间与侧别交互作用对移植脂肪组织质量维持率有显著的影响(F时间=126.54，F侧别=2471.83，F时间*侧别=30.43，P<0.05)。单独效应结果显示，7、14、28 d组裸鼠实验侧移植脂肪组织质量维持率呈逐渐降低(F=58.47，P<0.05)，对照侧移植脂肪组织质量维持率也逐渐降低(F=225.28，P<0.05)；3组裸鼠实验侧移植脂肪组织质量维持率均显著高于对照侧(F=1 490.66～2 142.95，P<0.05)。实验侧脂肪组织外观体积明显大于对照侧(图3)。

A：实验侧，B：对照侧

3 讨 论

脂肪颗粒来源于人体或动物皮下脂肪，取材广泛，且与机体相容性好、排斥性较低，是天然的生物填充材料[4]。移植自体脂肪的血管化一般发生在移植手术以后的24～48 h，脂肪血管化之前缺血缺氧的环境常导致脂肪细胞的坏死和吸收等[5-7]，提高自体脂肪移植后的存活率是自体脂肪移植手术成败的关键，也一直是整形外科医生的研究热点。另外，在脂肪移植过程中，许多患者因为体型瘦小，脂肪量较少而使脂肪取材困难[8-9]。因此本研究将原材料来源广泛、取材方便、易于培养、纯度高、免疫源性低、具有多向分化潜能的hUC-MSCs作为种子细胞诱导生成脂肪细胞，并探究hUC-MSCs生成的脂肪细胞与脂肪颗粒共同移植对移植后脂肪组织存活率的影响。本研究期望同时解决组织工程脂肪来源问题和提高自体脂肪移植存活率问题，为hUC-MSCs来源组织工程脂肪在整形外科的应用提供实验依据。

本研究使用hUC-MSCs来源的脂肪细胞与天然的脂肪细胞颗粒混合后移植于裸鼠腹部筋膜实验侧，并将对侧设置为对照侧。经对比研究发现，随着移植时间的延长，移植脂肪细胞质量维持率逐渐降低。但7、14、28 d组实验侧脂肪细胞质量维持率持续高于对照侧。由此可知，在移植脂肪组织中添加hUC-MSCs来源的脂肪细胞可以有效提高脂肪细胞的存活率，降低脂肪细胞的吸收率。

美国整形外科协会在讨论自体脂肪移植存在的问题和面临的挑战时指出，移植脂肪1年以上的存活率仅为30%，同时也质疑了脂肪移植后的长期维持率和实际存活率[10]。有研究证实，移植后的脂肪颗粒早期处于缺血缺氧状态，在这种环境中，脂肪组织会被液化和吸收。但缺氧对干细胞的旁分泌具有促进作用[11]，在缺血缺氧环境中，血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维生长因子(bFGF)在hUC-MSCs的旁分泌作用下，可出现明显的高表达。VEGF能促进血管内皮细胞的分裂和增殖，可有效促进脂肪移植后的血管化。bFGF是一种重要的有丝分裂刺激因子，可以促进新生血管形成。随着新生血管的形成，可以有效改善缺血缺氧的环境，从而提高移植脂肪组织的存活率。VEGF、bFGF等因子不仅可以加快新生血管的形成，而且具有明显的抗炎作用，可以有效促进脂肪组织移植后的成活[12-14]。因此本研究认为，移植进入裸鼠体内的hUC-MSCs来源的脂肪细胞仍然存在hUC-MSCs特性，在脂肪移植早期极度缺血缺氧状态下，仍然会通过旁分泌方式释放VEGF、bFGF等，加速移植脂肪组织中新生血管的形成，使血运快速重建，避免了脂肪细胞在长时间缺血缺氧状态下坏死，从而提高了移植脂肪细胞的存活率[15-16]。

综上所述，hUC-MSCs来源的脂肪细胞与天然的脂肪细胞颗粒混合后移植可以有效提高移植脂肪细胞的质量维持率。本研究为以hUC-MSCs为种子细胞的组织工程脂肪在脂肪移植中的应用奠定了实验基础。

本研究的局限性在于，由于经费和实验条件的限制，并没有探讨hUC-MSCs来源的脂肪细胞提高移植后脂肪存活率的具体机制，以后本课题组将对这方面进行更深入的研究。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

伦理批准和动物权利声明：本研究涉及的所有动物实验均已通过石家庄市人民医院医学伦理委员会的审核批准(文件号201912026)。所有动物处理和实验过程均遵照《中华人民共和国实验动物管理条例》的规定。

EthicsApprovalandAnimalRight： All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of Shijiazhuang People’s Hospital (Approval Letter No.201912026). All experimental animal protocols were carried out by following the guidelines of The Regulations of The People’s Republic of China on The Administration of Experimental Animals.

作者贡献：刘超、孙鹏飞参与了研究设计；刘超、魏计超、莫志洋、赵亚平、高慧、赵爱群、李燕、李素芬、孙鹏飞参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。

Contributions： The study was designed byLIUChao, andSUNPengfei.The manuscript was drafted and revised byLIUChao,WEIJichao,MOZhiyang,ZHAOYaping,GAOHui,ZHAOAiqun,LIYan,LISufen, andSUNPengfei. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.