胡淑慧 李长贵 路杰

(山东省代谢性疾病重点实验室，青岛市痛风病重点实验室，青岛大学附属医院内分泌与代谢病科，山东 青岛 266003)

高尿酸血症(hyperuricemia，HUA)是由于尿酸生成过多和(或)排泄不足引起的代谢异常综合征。近年来，我国HUA的发病人群呈现出年轻化的趋势[1-2]，总体患病率约达13.3%[3]。国内外大量的研究资料显示，HUA是慢性肾脏病发生和发展的独立危险因素[4-6]，血尿酸浓度长期呈过饱和状态，会加重肾脏负担，使尿酸结晶沉积于肾脏，导致不同程度的肾损害，称为尿酸性肾病(或痛风性肾病)[7-8]。随着病情的进展，尿酸性肾病最终可发展为肾衰竭，尿酸性肾病俨然成为威胁人类生命健康的重要疾病之一。然而，目前国内外对尿酸性肾病动物模型的开发仍处于早期阶段，主要通过增加尿酸摄入和(或)减少尿酸排泄两方面来实现，缺乏可靠的尿酸性肾病特征表型，这极大地阻碍了对其后续致病机制和新药开发的研究。本研究旨在探讨尿酸氧化酶(Uox)基因敲除小鼠的肾脏表型，明确其作为尿酸性肾病模型小鼠的可靠性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物及分组 选取Uox基因敲除小鼠(以C57BL/6J为遗传背景[9])16只，设为A组；同窝野生型小鼠16只，设为B组。两组小鼠均为雄性，8周龄，体质量(20±2)g，饲养于青岛大学附属医院SPF级动物房。

1.1.2试剂和仪器 CD3抗体(美国Santa Cruz Biotechnology公司)，CD68抗体(美国BioLegend公司)，非布司他(江苏恒瑞制药公司)。低温离心机(德国Eppendorf公司)，TBA-40FR型全自动血液生化仪(日本TOSHIBA公司)，自动脱水机(日本Sakura公司)，RM2235切片机购自于德国Leica公司，SMZ800解剖镜以及偏正光显微镜购自于日本Nikon公司。

1.2 实验方法

1.2.1生化指标检测 A、B两组小鼠各16只禁食过夜，次日8：00用异氟烷对小鼠进行气体麻醉，经内眦静脉采集500 μL静脉血至离心管中，室温下静置1 h，然后4 ℃下3 500 r/min离心20 min，分离出160 μL血清至洁净生化杯中。应用全自动血液生化仪测定两组小鼠血尿酸、血肌酐水平，每组测2次，计算平均值。

1.2.2肾脏病理标本制作 随机取A、B两组小鼠各4只。腹腔注射10 g/L戊巴比妥钠(60 mg/kg)麻醉小鼠，待小鼠无结膜反应及触痛反应后，开腹取出双侧肾脏。将取出的一侧肾脏迅速置于40 g/L多聚甲醛中，固定24 h后，用PBS冲洗3次，置于自动脱水机中进行脱水，石蜡包埋及切片。通过苏木精-伊红染色、Masson染色、抗CD3和抗CD68免疫组化染色，对比两组小鼠肾脏病理改变、纤维化程度及炎症状态。将取出的另一侧肾脏迅速置于无水乙醇中，固定24 h后石蜡包埋及切片，在偏振光显微镜下观察尿酸盐晶体沉积情况。

1.2.3降尿酸治疗 随机取A组小鼠6只，生理盐水溶解非布司他(0.8 g/L)后灌胃给药(8 mg/kg)；随机取B组小鼠6只及剩余A组小鼠6只，用生理盐水灌胃(10 mL/kg)作为对照。维持小鼠正常饲养，每日灌胃1次，连续灌胃4周后，比较不同处理的两组小鼠灌胃前后血尿酸、血肌酐的差值，每组测2次，计算平均值。观察非布司他给药后A组小鼠肾脏尿酸盐晶体沉积情况的变化。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 两组小鼠生化指标检测结果

A、B两组小鼠的血尿酸水平分别为(507.44±38.43)、(166.13±15.98)μmol/L，A组小鼠血尿酸水平显著高于B组(t=32.80，P<0.01)。A、B组小鼠血肌酐水平分别为(39.56±5.67)、(13.88±2.00)μmol/L，A组小鼠血肌酐水平显著高于B组(t=17.10，P<0.01)。

2.2 两组小鼠肾脏病理检测结果

肉眼下A组小鼠肾脏体积膨大，呈灰白色，被膜下散布乳白色颗粒，表面不平并见多个囊腔，皮髓质充血水肿，交界清晰；B组小鼠肾脏表面光滑，呈浅褐色，皮髓质交界清晰。

光镜下，苏木精-伊红染色显示，A组小鼠肾脏肾盂明显积水，肾脏结构异常，呈空洞状，肾皮质变薄，伴肾脏部分萎缩；B组小鼠肾脏结构正常。高倍镜下显示，A组小鼠肾单位结构异常，肾小球聚集伴轻度萎缩，鲍曼氏囊扩张，肾小管空泡变性伴刷状缘脱落，部分肾小管呈不同程度扩张，肾间质轻度水肿；B组小鼠肾单位结构完整，未见明显病理改变。Masson以及抗CD3、抗CD68免疫组织化学染色结果显示，A组小鼠肾脏间质大量蓝绿色胶原纤维沉积，纤维化损伤严重，并且伴有包括CD3+中性粒细胞、CD68+巨噬细胞在内的大量炎性细胞浸润；B组小鼠肾脏间质结构正常，没有明显炎症细胞浸润。见图1。

图1 两组小鼠肾脏病理学检查结果(200倍)Fig.1 Renal pathological results of the two groups (×200)

2.3 各组降尿酸治疗效果

经非布司他灌胃后的A组小鼠与生理盐水灌胃的A组、B组小鼠相比，治疗前后血尿酸水平差值和血肌酐水平差值均有显著性差异(F=195.54、42.20，P<0.01)。见表1。

表1 不同处理的两组小鼠血尿酸、血肌酐水平的变化Tab.1 Changes in the levels of serum uric acid and serum creatinine in two groups after different treatments

同时，非布司他治疗前A组小鼠肾脏可见明显的尿酸盐晶体(棕色晶体)沉积(图2A)，B组小鼠肾脏无明显的尿酸盐晶体沉积(图2B)；但经非布司他治疗4周后，A组小鼠肾脏尿酸盐晶体沉积明显减少(图2C)。

A：非布司他治疗前A组小鼠肾脏尿酸盐晶体沉积情况，B：非布司他治疗前B组小鼠肾脏尿酸盐晶体沉积情况，C：非布司他治疗后A组小鼠肾脏尿酸盐晶体沉积情况图2 两组小鼠肾脏尿酸盐晶体沉积情况(400倍)Fig.2 Deposition of urate crystals in the kidney of the two groups (×400)

3 讨 论

肾脏是尿酸最常损害的靶器官之一，高水平的尿酸通过直接或间接作用导致肾脏损伤，引发尿酸性肾病。据统计，在79%～99%的痛风患者尸检中可观察到尿酸性肾病典型的病理改变，即肾间质和肾小管内大量双折光的针状尿酸盐结晶沉积，周围伴有炎性细胞浸润，肾小管上皮细胞坏死，肾小管萎缩，间质纤维化，严重者肾单位毁损[10]。

Uox是参与嘌呤代谢的重要酶，在大多数哺乳动物中，能够将尿酸氧化为更易于溶解的尿囊素，并排出体外[11]。然而，由于Uox基因在人类和类人猿进化过程中经历了沉默突变，人体缺乏功能性尿酸氧化酶，尿酸成为人体内嘌呤的代谢终末产物，导致人类尿酸水平是啮齿动物的5～10倍[12]。在尿酸生成过多和(或)排泄不足的情况下，血清尿酸浓度将会升高，随着病情的发展，最终引起尿酸性肾病。

本研究结果显示，Uox基因敲除小鼠血尿酸水平>420 μmol/L，达到人类HUA的诊断标准。Uox基因敲除小鼠血肌酐水平显著高于同窝野生型小鼠，并且存在明显的尿酸性肾病的特征，肾间质和肾小管有大量尿酸盐结晶沉积，肾脏结构异常，存在明显肾盂积水、鲍曼氏囊和肾小管扩张、肾间质纤维化和大量炎性细胞浸润。未经治疗的Uox基因敲除小鼠血尿酸持续处于高水平，随着时间的延长，肾功能损害加重；而经非布司他治疗4周后的Uox基因敲除小鼠，血尿酸、血肌酐水平显著改善，肾脏尿酸盐晶体沉积明显减少，表明降尿酸治疗不仅可以有效降低Uox基因敲除小鼠血尿酸水平，并可进一步缓解其肾功能损伤，减少肾脏沉积的尿酸盐晶体。以上结果支持尿酸性肾病小鼠模型构建成功。

目前，国内外尿酸性肾病的造模方式主要有两种：药物诱导和基因修饰。传统的尿酸性肾病模型多采用药物诱导方式[13]，但药物诱导的小鼠模型存在药物剂量不准确、血尿酸水平波动大、肾脏损伤轻重不一、有的药物本身就具有肾毒性等缺点，不适宜进行长期实验。WU等[14]构建了第一个Uox基因定点突变的小鼠模型，但该突变小鼠血尿酸水平极高，约为野生型小鼠的10倍，肾脏损害严重，严重的HUA和肾病导致半数以上的小鼠存活期不超过4周，因此无法实施长期的实验。此外，PREITNER等[15-16]构建了肝脏特异性Glut9基因敲除的小鼠模型，但此小鼠血尿酸轻度升高，明显低于人类病理水平，补充肌酐后使血尿酸升高，肾脏表现出尿酸盐结晶沉积、炎症和间质纤维化，但额外干预会干扰尿酸本身的作用，影响对其机制的研究。而本研究应用的Uox基因敲除小鼠，不仅与人类尿酸性肾病发病机制更接近，而且成模时间短、高尿酸水平稳定、尿酸性肾病表型典型，是更为理想的尿酸性肾病模型。

既往普遍认为尿酸性肾病的发病机制主要是由于尿酸盐沉积于肾脏的直接作用[17]，但现在越来越多的临床前数据表明，尿酸还可通过多种非晶体机制诱发尿酸性肾病[18-19]。研究表明，尿酸除了可以直接刺激血管平滑肌细胞增殖外，还可以激活肾素-血管紧张素系统和血管紧张素Ⅱ/环氧酶2/血栓素A2通路，引起肾小球入球小动脉管腔狭窄、肾小球及球后循环缺血[20-21]。此外，尿酸可通过降低致密斑一氧化氮合酶的表达，减少一氧化氮的合成，从而导致内皮细胞的功能异常，进一步加重尿酸性肾病[22]。长期的HUA可刺激血管内皮细胞等合成活性氧，进而引起DNA的损伤、酶的氧化和失活、炎性细胞因子的产生和细胞凋亡[23-25]。另有研究证实，轻度HUA即可造成肾损害和肾功能障碍，其机制可能与促炎途径有关[26]。肾小管间质纤维化是尿酸性肾病的典型特征，尿酸主要通过激活肿瘤坏死因子-β/Smad3、表皮生长因子受体和细胞外信号调节激酶1/2通路促进肾脏纤维化[27]，内质网应激也与肾脏纤维化密切相关[28-29]。总之，尿酸可以通过直接和间接作用导致尿酸性肾病，而稳定可靠的动物模型是其进一步研究的前提。

综上所述，该Uox基因敲除小鼠表型可作为尿酸性肾病的应用模型，为日后尿酸性肾病的深入研究奠定基础。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

伦理批准和动物权利声明：本研究涉及的所有动物实验均已通过青岛大学附属医院医学伦理委员会的审核批准(文件号QYFYWZLL-25983)。所有实验过程均遵照《中华人民共和国实验动物管理条例》的条例进行。

EthicsApprovalandAnimalRight： All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of The Affiliated Hospital of Qingdao University (Approval Letter No.QYFYWZLL25983), and all experimental animal protocols were carried out by following the guidelines of The People’s Republic of China on the Administration of Experimental Animals.

作者贡献：路杰、李长贵参与了研究设计；胡淑慧、路杰参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。

Contributions： The study was designed byLUJieandLIChanggui. The manuscript was drafted and revised byHUShuhuiandLUJie. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.