吴升浩 胡杨杨 刘晓明

温州医科大学附属第二医院生殖医学中心（浙江温州 325000）

不孕不育已经成为一个全球性的医疗和社会问题。近年来，不孕不育症的发病率在发达国家和发展中国家都在持续上升。统计数据表明，不孕不育的病因接近一半是由男性因素引起的，其中无精子症占到了男性不育的5%。无精子症可分为梗阻性无精子症（OA）和非梗阻性无精子症（NOA）［1-3］。梗阻性无精子症是生殖男科的一种常见疾病，占无精子症的40%。该疾病是由于睾丸网和射精管之间任一位置的阻塞导致的［4-5］。随着在1997年有学者首次报道了通过经皮睾丸穿刺精子抽吸术（TESA）获得的睾丸精子用于卵胞浆内单精子注射（ICSI）进行辅助生殖，该项技术目前得到了广泛的应用，为无精子症患者带来了生育的希望。近年来，在辅助生殖中冻融胚胎移植（FET）比例不断增加，其妊娠结局也受到了越来越多的关注［6］。目前有较多研究报道了关于试管婴儿中新鲜移植与FET 对妊娠结局的影响，张敏等［7］比较了卵巢正常反应患者新鲜胚胎移植和第1 次FET 的临床结局，发现新鲜胚胎移植和FET 的临床结局是相似的。而LIU 等［8］在2019年开展的一项回顾性队列研究中发现，对于获卵数在3 ～10 个的女性患者FET 可以获得更好的妊娠结局。另外有研究比较了新鲜胚胎移植和FET后妊娠早期胎儿生长发育的速度，发现FET 胎儿妊娠早期生长速度明显升高，认为这可能与巨大儿有关［9］。但是上述类似研究中男性配偶使用的均是射出精子，由于睾丸精子与射出精子相比在成熟度和功能结构上均有所不同［10］，而且目前尚没有关于使用睾丸精子进行ICSI 后新鲜和冻融胚胎移植妊娠结局的研究，因此本文回顾性分析了2017-2020年在本中心行TESA 获得睾丸精子并后续行ICSI 助孕的OA 患者资料，探讨使用睾丸精子ICSI 后的囊胚移植策略，这对OA 患者的辅助生殖助孕具有重要意义，也为今后临床上OA 患者根据个体差异化特征选择不同移植策略提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2017年1月至2020年12月在我院生殖中心行TESA-ICSI 的患者夫妻资料。纳入标准：（1）男方为无精子症患者，穿刺睾丸有精子；（2）女方年龄＜40 岁，均为首次行TESAICSI 并行新鲜或者冷冻囊胚移植，移植胚胎为1 ～2枚评分3BC或3BC以上囊胚；（3）女方卵巢储备功能正常：抗苗勒管激素（AMH）＞1.2 ng/mL，基础卵泡刺激素（FSH）≤10 IU/L，窦卵泡计数（AFC）≥5个。排除标准：（1）患者信息不全或缺失；（2）女方有严重影响胚胎种植的因素：严重输卵管积水、子宫内膜异位症、子宫腺肌症、宫腔粘连、子宫畸形、免疫功能异常和凝血功能异常等；（3）配偶有可能干扰妊娠结果的其他疾病。本研究共纳入340个移植周期，其中冻融囊胚行冷冻移植的有162 周期（冷冻周期组），新鲜囊胚移植的有178周期（新鲜周期组）。本研究经温州医科大学附属第二医院医学伦理委员会批准（伦理编号：2021-K-74-02），符合《赫尔辛基宣言》的宗旨。所有参与者均获知情并签署书面知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 促排卵方案和卵母细胞的收集 促排卵方案采用本生殖中心常规的卵泡期超长方案（C1），所有纳入患者均在月经周期第1 ～5天注射3.75 mg长效醋酸亮丙瑞林（贝依，上海丽珠制药）降调节。在成功降调后的第32 ～38 天使用促性腺激素（果纳芬，瑞士雪兰诺大药厂）开始启动促排卵治疗，剂量根据血清雌二醇（E2）、黄体生成素（LH）、孕酮（P）水平和窦卵泡的大小来调整。当有2 ～3个卵泡直径≥18 mm，或至少有1 个卵泡直径≥20 mm时，选择注射用绒促性素（HCG，上海丽珠制药）10 000 U扳机。36 ～38 h后经阴道超声引导下取卵。

1.2.2 睾丸精子的获取 平卧位，常规消毒铺巾，用2%的利多卡因对睾丸进行局部麻醉。用一个23 号针头与含有5% G-MOPS 培养基（Vitrolife）的5 mL 注射器相连，通过阴囊皮肤刺入睾丸以获得足够的睾丸组织。采集后，立即将睾丸组织放在一个装满HEPES-缓冲培养基（G-MOPS）的盘子里，并送至实验室进行显微镜检查。用无菌空针将获得的睾丸组织碾碎，并在显微镜下（× 400）检查悬浮液的精子形态质量和运动能力。

1.2.3 受精、胚胎评估和胚胎移植 获取的卵母细胞采用睾丸精子常规行ICSI 受精和胚胎培养。观察并记录ICSI 后第3、5、6 天的胚胎受精、卵裂情况和囊胚形成情况。根据Gardner 囊胚分级系统选择优质囊胚进行新鲜周期移植或者FET。FET 患者采用人工周期方案准备内膜，待内膜厚度≥8 mm 时转化内膜，移植后继续激素维持治疗。

1.2.4 妊娠结局判断 移植囊胚14 d 后测量血清β-HCG 以确定妊娠状态。临床妊娠被定义为移植后约4 周内出现带有卵黄囊的孕囊和胎心搏动。活产被定义为妊娠≥24 周的活体婴儿出生。出生体质量＜2 500 g 的婴儿为低出生体质量。

1.3 评价指标 记录并比较两组基本临床资料［男女年龄、不育年限、促黄体生成素（LH）、促卵泡生成素（FSH）、催乳素（PRL）、雌二醇（E2）、睾酮（T）、AMH、BMI、扳机日子宫内膜厚度］、妊娠结局（平均移植囊胚数、种植率、临床妊娠率、多胎妊娠率、流产率、早产率、活产率）和新生儿情况（妊娠周数、新生儿体质量、低体质量新生儿发生率、出生性别比）。

1.4 统计学方法 所有资料均采用软件SPSS 22.0进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示，比较采用t检验；计数资料采用例（%）表示，比较采用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况比较 冷冻周期组女方平均年龄为（29.45 ± 5.08）岁，新鲜周期组女方平均年龄为（29.42 ± 4.75）岁；冷冻周期组男方平均年龄为（32.01 ± 5.69）岁，新鲜周期组男方平均年龄为（32.57 ± 5.93）岁，两组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。两组不孕年限、性激素、BMI 及扳机日子宫内膜厚度比较差异也均无统计学意义（P＞0.05）。两组具有可比性，见表1。

表1 两组患者的临床资料比较Tab.1 The comparison of clinical data in two groups ±s

表1 两组患者的临床资料比较Tab.1 The comparison of clinical data in two groups ±s

项目女性年龄（岁）男性年龄（岁）不育年限（年）女LH（IU/L）女FSH（IU/L）女PRL（ng/mL）女E2（pg/mL）女T（ng/mL）女AMH（ng/mL）男LH（IU/L）男FSH（IU/L）女BMI（kg/m2）男BMI（kg/m2）扳机日子宫内膜厚度（mm）冷冻周期组（n=162）29.45±5.08 32.01±5.69 3.82±3.25 5.16±2.34 6.15±2.25 9.49±4.28 26.21±8.14 5.00±1.78 3.22±1.28 7.33±3.11 9.61±5.04 21.89±1.81 23.24±4.37 11.07±3.00新鲜周期组（n=178）29.42±4.75 32.57±5.93 3.88±3.10 5.06±2.29 6.55±2.24 9.14±4.42 26.69±7.86 5.05±1.75 3.51±1.58 7.99±3.62 9.12±4.70 21.95±1.76 23.80±3.66 10.98±2.81 t值0.064 0.832 0.175 0.378 1.527 0.697 0.514 0.248 1.802 1.703 0.867 0.302 1.176 0.287 P值0.949 0.406 0.861 0.706 0.128 0.486 0.608 0.804 0.073 0.090 0.387 0.763 0.241 0.775

2.2 两组妊娠结局比较 在平均移植囊胚数相似的情况下，两组的种植率、临床妊娠率、多胎妊娠率、流产率、早产率和活产率差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 两组患者的妊娠结局对比Tab.2 The comparison of pregnancy outcomes in two groups例（%）

2.3 两组新生儿结局比较 截止随访，冷冻周期组有84 例新生儿出生，早产儿有13 例；新鲜周期组有102 例新生儿出生，早产儿有6 例。冷冻周期组的平均妊娠时间（gestation length）少于新鲜周期组，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。两组的平均出生体质量、低体质量新生儿率和出生性别比差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 两组新生儿结局比较Tab.3 The comparison of neonatal outcomes between the two groups ±s

表3 两组新生儿结局比较Tab.3 The comparison of neonatal outcomes between the two groups ±s

结果妊娠周数新生儿体质量（g）低体质量新生儿发生率［例（%）］出生性别比［男（%）］冷冻周期组（n=84）37.99±2.30 2 992.77±594.67 13（15.5）42（50.0）新鲜周期组（n=102）38.61±1.29 3 128.13±536.01 13（12.8）48（47.1）χ2/t 值2.200 1.617 0.286 0.160 P 值0.030 0.108 0.593 0.690

3 讨论

随着胚胎冷冻解冻技术的发展和应用，FET在辅助生殖中的比例不断的提升，新鲜周期移植和FET 对妊娠结局的影响成为了辅助生殖领域关注的焦点。既往相关研究中男性配偶使用的多为射出精子，尚没有使用睾丸精子的相关研究报道，由于睾丸精子与射出精子在功能成熟度等方面存在差异性，因此很有必要探讨对于使用睾丸精子ICSI 后囊胚移植策略。本研究回顾性分析比较了使用睾丸精子进行ICSI 后新鲜和冻融囊胚移植妊娠结局和新生儿结局的差异性，本研究结果表明两组在临床妊娠率、早产率和活产率等方面无明显差异，进一步研究新生儿结局发现，两组的新生儿出生体质量也是类似的。

目前有较多研究报道了关于辅助生殖中冻融与新鲜胚胎移植对妊娠结局和新生儿的影响［11-14］，但对于两种移植方式的优缺点临床上尚存有争议。在体外受精中，移植新鲜胚胎通常比移植冷冻胚胎更受青睐，VUONG 等［15］研究发现，在接受试管婴儿助孕的不孕妇女中，冷冻胚胎移植与新鲜移植相比，妊娠结局没有明显差异。潘丹等［16］回顾性分析比较了行试管婴儿助孕的患者新鲜移植与第一次冻融胚胎移植的妊娠结局，发现新鲜周期移植的临床妊娠率、活产率等与FET是相似的，从患者经济效益角度考虑，建议选择新鲜周期移植。但是在另一项大型的多中心试验中发现，对于行试管婴儿助孕的患者来说，FET 有较高的活产率，但是移植后发生子痫前期的风险更高［17］。习艳霞等［18］的研究与上述结果相似，认为FET 能够获得更高的妊娠率和更好的临床结局。

上述相关研究纳入的病例使用的精液来源均是男方射出精子，目前尚没有文献报道使用睾丸精子ICSI 助孕后的不同移植周期的妊娠结局差异。既往研究认为，睾丸精子与射出精子相比，在成熟度、核完整性、运动能力和形态等方面均存在差异性［19-21］。在本研究中，TESA 获得的睾丸精子与射出精子相比数目更少，显微镜下检查多为不动精子，少见活动精子，由于未经附睾进一步发育，多表现为不成熟精子。不同来源的精子对试管婴儿治疗结局也造成了不同的影响，张志宏等［22］的研究发现睾丸精子经ICSI 治疗后正常受精率和优质胚胎率均低于射出精子，这可能与睾丸精子成熟度低有关。因此有必要对经睾丸精子ICSI 受精后的胚胎移植策略进行探讨。本研究表明，对于除女方不育因素外的OA 患者来说，ICSI治疗后囊胚FET 和新鲜移植的妊娠结局差异无统计学意义，虽然FET 组的平均妊娠时间（gestation length）较新鲜移植组略短，但两组的新生儿结局包括早产率、平均出生体质量和低出生体质量率均没有差异性。

对于行试管婴儿助孕的患者夫妇来说，整个治疗过程中生育压力均会持续存在，而FET 会延长患者从助孕到获得活产新生儿的时间，另外额外的冷冻复苏费用会增加患者的经济成本。LE等［23］进行了一项非PCOS 患者FET 与新鲜周期移植的RCT 研究，并进行了成本效果分析，发现两组的妊娠结局和平均治疗成本是相似的（P＞0.05），但新鲜移植周期每一活产新生儿的成本是低于FET 组的。另外一方面冷冻复苏技术对于胚胎的潜在影响也是FET 的不可忽视因素。因此本研究结果提示，对于使用睾丸精子进行试管婴儿助孕的无精子症患者临床上应尽可能选择新鲜移植。

本研究尚存在局限性，由于随访时间较短，因此新鲜移植或者FET 对于新生儿生长发育的长期影响还缺乏相关数据。另外本研究为回顾性分析，未来仍然需要大样本随机对照试验（RCT）证据证明两种不同移植策略对妊娠结局的影响。

综上所述，对于梗阻性无精子症患者，经睾丸精子ICSI-ET 选择新鲜或者冷冻周期囊胚移植对妊娠和新生儿结局没有影响。但未来需要RCT 进一步的深入研究。