黄帅 黄国樑 令狐熙涛 谢尚延 瓦庆德 郭远清 黄彦

1广州医科大学附属第二医院骨科（广州 510260）；2遵义医科大学第二附属医院骨科（贵州遵义 563000）；3中山大学附属第五医院脊柱外科（广州 528406）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性最常见的以广泛骨转移为主要特征的恶性肿瘤之一，近年来我国PCa 发病率也呈逐渐上升趋势［1-2］。PCa患者一旦并发骨转移后可引起高钙血症、病理性骨折和骨骼剧烈疼痛等多种并发症［3-4］。PCa 的发生发展与肿瘤酸性微环境密切相关，PCa 细胞在生长与转移过程中通过掠夺和优先代谢营养物质形成独特的酸性微环境，进一步促进PCa 细胞的增殖、迁移及干细胞特性等［5-6］。因此，通过降低PCa细胞在酸性微环境中的生长和转移特性，有望成为一种新的PCa 治疗策略。桦木酸（betulinic acid，BA）是一种五环三萜类活性成分，具有显著的抗瘤活性、调节免疫和抗氧化应激等多种作用，能抑制黑色素瘤、乳腺癌、肺癌等肿瘤的生长与转移［8-9］。然而，BA 对PCa 骨转移的潜在抑制作用尚未见报道。因此，本研究旨在探索BA 在酸性条件下对PC-3 细胞的增殖、迁移、干性及破骨细胞分化的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 RPMI 1640培养基、DMEM培养基、10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素（美国Gibco 公司），桦木酸、MMP 抑制剂GM6001（美国Sigma 公司），重组人表皮生长因子EGF、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、B27 添加物、胰岛素（美国eBioscience公司），CD31、CD44、α-tublin、MMP-9、E-Cadherin 和RANKL 单克隆抗体（美国CST 公司），ECL 增强化学发光剂（碧云天生物科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人前列腺癌细胞株PC-3 和RAW264.7 细胞购于中国科学院细胞库，分别在含10%胎牛血清及1%青霉素-链霉素的1640培养基和DMEM 培养基培养，培养环境均为5% CO2、37 ℃。将微量HCL 和NaOH 溶液加入1640 培养基中并采用滴定法将培养基pH 值调至7.4 和6.5 模拟酸性微环境。

1.2.2 CCK-8 试验 0.25%胰蛋白酶消化PC-3 细胞后用RPMI 1640 培养基重悬，调整浓度为5×104个/mL 并接种于96 孔培养板中，待细胞贴壁后加入浓度为0、1、5、10、15、20、30、40 μmol/L 桦木酸溶液，每组5 个复孔。24 h 后加入CCK-8 工作液10 μL，继续孵育2 h 后通过酶标仪检测450 nm 处各孔吸光度值，实验重复3 次。

1.2.3 Transwell 试验 按pH 7.4、pH 6.5、pH 6.5+BA 10 μmol/L、pH 6.5+BA 15 μmol/L分别处理PC-3细胞，24 h 后胰酶消化重悬，调整细胞数至1 × 106个/mL，然后将200 μL 细胞悬液接种于Transwell上室。并向下室分别加入含MMP 抗体（1∶800）、抑制剂GM6001（0.5 nmol/L）的1640 培养基。继续培养24 h 后取出Transwell 小室，清除上室细胞，多聚甲醛固定30 min 后结晶紫染色，在显微镜下拍照并随机计数。

1.2.4 黏附试验 按pH 7.4、pH 6.5、pH 6.5+ BA 10 μmol/L、pH 6.5+ BA 15 μmol/L 分别处理6 孔板中PC-3 细胞。24 h 后胰酶消化重悬细胞密度至1× 106个/孔，将细胞悬液接种在FN 包被的96 孔板中，2 h 后用BSA 封闭30 min，PBS 清洗2 次后多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色，拍照计数。

1.2.5 成球试验 按pH 7.4、pH 6.5、pH 6.5+ BA 10 μmol/L、pH 6.5+BA 15 μmol/L 分别处理PC-3 细胞，然后用无血清1640 培养基（含20 ng/mL bFGF和EGF、1×B27）悬浮细胞至1 × 106个/mL，接种于培养板中继续培养14 d 计数每孔肿瘤球数。

1.2.6 qPCR 按pH 7.4、pH 6.5、pH 6.5+ BA 10 μmol/L、pH 6.5+ BA 15 μmol/L 分别处理PC-3 细胞，24 h 后提取细胞总RNA 并用逆转录试剂盒制备cDNA 文库（样品为2 μg）。使用实时PCR 试剂盒进行PCR 扩增共40 个循环。以GAPDH 作为对照，通过2-ΔΔCT法计算CD31、CD44 的mRNA 相对表达量。基因引物序列如下：CD31：F 5′-ACATGGCAACAAGGCTGTGTA-3′、R 5′-CCTCAAACTGGGCATCATAAG-3′；CD44：F 5′-ACCCCAACTCCATCTGTGC-3′、R 5′-TTCTGGACATAGCGGGTG-3′；GAPDH：F 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′、R 5′-GAAGATGGTG-ATGGGATTTC-3′。

1.2.7 Western blot 按pH 7.4、pH 6.5、pH 6.5+BA 10 μmol/L、pH 6.5+BA 15 μmol/L 分别处理PC-3 细胞，24 h 后提取总蛋白，BCA 法定量。按30 μg/孔将蛋白样品加入凝胶中电泳120 min，然后电转90 min，脱脂奶粉缓冲封闭2 h，洗涤后加入一抗稀释液CD31（1∶1 000）、CD44（1∶1 000）和α-tublin（1∶1 000）4 ℃封闭过夜。室温震荡1 h 后加入相应二抗（1∶2 000），洗膜40 min 后用ECL 试剂盒检测，实验重复3 次。

1.2.8 破骨细胞分化试验及酸性磷酸酶（TRAP）染色 首先在6 孔板中按pH 7.4 组、pH 6.5 组、pH 6.5+ BA 10 μmol/L 组、pH 6.5+ BA 15 μmol/L 组处理细胞24 h，分别收集上清液后离心5 min，去渣后获得条件培养基。然后将RAW264.7 细胞接种至6 孔板中，贴壁后分别与条件培养基和RANKL抗体（1∶1 000）共同孵育，7 d 后使用TRAP 试剂盒进行染色。

1.2.9 统计学方法 所有数据用（）表示，统计分析和作图使用SPSS 22.0 及GraphPad Prism 软件，采用t检验、单因素方差分析数据，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BA 抑制PC-3 细胞增殖 CCK-8 实验结果表明与中性pH 7.4（对照组）相比，pH 6.5 酸性微环境促进细胞的增殖，而不同浓度的BA 溶液以浓度依赖性抑制酸性微环境中PC-3 细胞的增殖能力，差异有统计学意义（P＜0.01，图1）。

图1 BA 抑制PC-3 细胞在体外的增殖Fig.1 BA inhibited PC-3 cells proliferation in vitro

2.2 BA 抑制PC-3 细胞迁移 Transwell 试验结果显示酸性微环境促进PC-3 细胞的迁移能力，10 μmol/L 和15 μmol/L 的BA 溶液抑制PC-3 细胞的迁移能 力（P＜0.05），与MMP-9 抗体和抑制 剂GM6001 的抑制效应一致（图2）。

图2 BA 抑制PC-3 细胞的迁移（×100）Fig.2 BA inhibited migration of PC-3 cells in vitro（×100）

2.3 BA 抑制PC-3 细胞黏附 基质黏附实验发现酸性微环境能提高PC-3 细胞与基质间的黏附能力，分别在酸性微环境中添加10、15 μmol/L 浓度的BA 溶液和E-Cadherin 抗体后，PC-3 细胞的迁移能力显著减弱（P＜0.05，图3）。

图3 BA 抑制PC-3 细胞的黏附（×100）Fig.3 BA inhibited the adhesion ability of PC-3 cells in vitro（×100）

2.4 BA 抑制PC-3 细胞干细胞特性 成球实验结果发现PC-3细胞在酸性微环境中的成球能力增强，而10 μmol/L和15 μmol/L的BA则抑制PC-3细胞在酸性微环境中的成球能力（P＜0.05，图4A-B）。同时BA 显著下调PC-3 细胞中CD31、CD44 的表达水平（P＜0.05，图4C-E）。

图4 BA 抑制PC-3 细胞的干细胞特性（×100）Fig.4 BA inhibited the stem cell property of PC-3 cells in vitro（×100）

2.5 BA 抑制PC-3 细胞诱导的RAW264.7 细胞成骨分化 破骨细胞分化实验发现酸性微环境能促进PC-3细胞诱导的破骨分化，添加10、15 μmol/L 的BA 溶液后，PC-3 细胞诱导的破骨分化作用显著减弱（P＜0.05，图5）。

图5 BA 抑制PC-3 细胞诱导的破骨细胞生成（×100）Fig.5 BA inhibited the PC-3 cells-induced osteoclastogenesis（×100）

3 讨论

酸性微环境与肿瘤生长与转移密切相关，对PCa 的生长和骨转移中起着重要作用［10-11］。前期研究中发现pH 6.5 的酸性微环境能增强PC-3 细胞的侵袭、干细胞特征［5］，因此在本研究中继续用pH 6.5 的培养基作为酸性微环境模拟条件，以探索BA 在酸性微环境中对PC-3 细胞的影响。BA 是一种五环三萜类化合物，其通过诱导细胞凋亡、调节细胞周期和抑制自噬发挥抗瘤、抗炎和抗氧化活性［12-13］。SELVANATHAN 等［14］发现BA 可通过激活AMPK 信号抑制胰腺癌细胞的干细胞特性和EMT 过程。HSIAO 等［15］发现BA 通过靶向NF-κB通路抑制胃癌细胞增殖和迁移。但BA在酸性微环境中对PCa 细胞生长与骨转移的影响尚不清楚，在本研究中首先通过CCK8 检测了BA 对PC-3 细胞增殖的影响，结果显示pH 6.5酸性微环境能增强PC-3细胞的增殖，而BA 则呈浓度依赖性抑制PC-3 细胞的增殖，表明BA具有抑制PC-3细胞生长的活性。

迁移和黏附是肿瘤转移的两个关键步骤，基质金属蛋白酶（MMPs）可以通过水解多种细胞外基质成分以促进肿瘤细胞的迁移和侵袭，E-cadherin蛋白则是介导细胞间黏附的关键跨膜糖蛋白［16］。EKANEM 等［17］和ZHANG 等［18］发现过表达MMP2 和MMP9 或下调MMP9 可抑制胶质瘤、卵巢癌细胞的转移，而E-cadherin的表达异常会改变前列腺癌、肺癌的转移特性［19］。在本研究中分别采用了Transwell试验和黏附试验评估BA 在酸性微环境中对细胞迁移和黏附的影响，结果显示酸性微环境促进PC-3 细胞的迁移和黏附，而加入10、15 μmol/L 的BA 溶液则显著抑制PC-3 细胞的迁移和黏附，其抑制效果与使用MMP 抗体、MMP 抑制剂GM6001 和E-cadherin 抗体阻断MMP 与E-cadherin 一致，提示BA 溶液能通过抑制PC-3 细胞在酸性微环境中的迁移和黏附能力发挥抗PCa 转移活性。前列腺癌干细胞对PCa 骨转移的发生起着关键作用，消除PCa干细胞是一种潜在的PCa治疗策略［20］。本研究采用成球试验检测BA 在酸性微环境中对PC-3 细胞成球能力的影响，结果表明pH 6.5 的酸性微环境促进了PC-3 细胞的成球能力，而BA 抑制PC-3细胞的成球能力，同时BA 抑制干性标记基因CD31、CD44 的表达，上述结果证实BA 能抑制酸性微环境中PC-3 细胞的干细胞特性。在PCa 骨转移过程中，破骨细胞被异常激活并导致骨质破坏从而诱发骨不良相关事件，而阻断RANKL 分子则能抑制破骨细胞分化，从而改善PCa 骨转移患者临床症状。在成骨分化实验中，发现RANKL 抗体对PC-3细胞诱导的成骨分化与酸性微环境中BA溶液诱导结果一致，均能抑制PC-3 细胞诱导的成骨分化，提示BA是一种有效的破骨细胞生成抑制剂。

综上所述，BA 可以抑制PC-3 细胞在酸性微环境中的增殖、迁移及干细胞特性，同时能显著抑制PC-3 细胞诱导的破骨细胞分化，上述结果提示桦木酸可能是一种有效的抗PCa 骨转移活性成分，为后续开发新型抗PCa 药物提供了前期试验依据。但其有关的作用机制和体内抑瘤效应尚未探索和验证，下一步将在本研究结果基础上更深入的研究BA发挥抗PCa作用的具体机制和体内效果。