◎ 王孟华，张国龙，金 鑫，蔡卫国，窦 天，申志鹏，郭江红，文 觅

（宜昌三峡普诺丁生物制药有限公司，湖北 宜昌 443000）

玉米浆（Corn Steep Liquor，CSL）是玉米通过湿法工艺生产淀粉过程中得到的副产物，其含有大量的营养物质，如葡萄糖、半乳糖、蛋白质、磷和各种氨基酸如谷氨酸、组氨酸、精氨酸等[1-2]。玉米浆主要用作水溶性植物蛋白及水溶性维生素、纤维饲料以及发酵氮源等[3]。在氨基酸发酵中，玉米浆成本低廉且可以提供氮源和生长因子，因此常被用作酵母粉、豆粕水解液等氮源的替代物，以达到降低生产成本的目的[4-6]。玉米浆中各类元素的种类及含量对异亮氨酸的发酵生产具有重要影响，而其中的磷元素能够控制菌体DNA、RNA和蛋白质的合成，也能够控制菌体中的糖代谢、细胞的呼吸作用，因此具有较高的研究价值[7-8]。 基于此，本文主要针对玉米浆中磷元素的含量对异亮氨酸发酵效率的影响展开研究。

1 材料与方法

1.1 菌种及培养基

谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）保藏号为M2019695。

培养基组成为口服葡萄糖14.0%、硫酸铵3.5%、玉米浆2.0%（河南鑫洋实业有限责任公司）、磷酸二氢钾（0%～0.4%）、硫酸镁0.05%、碳酸钙3.5%和菲汀（0%～0.5%），调节pH值为7.0±0.1。

1.2 实验方法

1.2.1 测定方法

使用HPLC检测异亮氨酸发酵液的含量。对5个批次玉米浆中溶磷和总磷含量的测定均采用钒钼磷酸比色法[9-10]。

1.2.2 色谱条件

缓冲液：0.2 mol·L-1磷酸二氢钠，用磷酸调pH至 2.8；流动相：乙腈和缓冲液（2∶98）；检测波长： UV 210 nm；色谱柱：C18（150 mm×4.6 mm，3 μm）；柱温：40 ℃；流速：0.5 mL·min-1；进样体积：20 µL[11]。

1.2.3 样品处理

按配方将物料装入三角瓶中，于0.04～0.06 MPa、 110～114 ℃湿热灭菌10～15 min，稍冷后放入无菌室备用。按无菌操作要求，用接种铲挑取新鲜斜面上的适量菌种，接入制备好的培养基中，放入恒温培养振荡器内，（30±2）℃恒温条件下培养64～80 h后进行产酸测定[12]。

2 结果与分析

2.1 5个批次玉米浆磷含量及对产酸的影响

对5个批次的玉米浆样品进行了溶磷（无机磷）以及总磷含量的测定，结果见表1。实验结果显示 5个批次的玉米浆样品中溶磷和总磷的含量均不一致，其中样本3的总磷和溶磷含量最低，溶磷和有机磷之比也最低，为0.75；样本1的总磷和溶磷含量最高，溶磷和有机磷之比也最高，为2.77。

表1 不同批次玉米浆溶磷及总磷含量表

采用5个玉米浆样品进行了摇瓶发酵实验，摇瓶编号1～5分别添加不同的玉米浆样品，每个样品设置3个重复。发酵结束后，检测15个异亮氨酸发酵的摇瓶清液中异亮氨酸含量，结果见表2。实验结果显示样本3的产酸最高，为2.90 g/100 mL，样本1的产酸最低，为1.88 g/100 mL。

为了进一步探究玉米浆中磷元素含量对产酸的影响，本研究结合表1和表2实验结果进行了进一步分析，分析结果显示，当样本中的溶磷∶有机磷的值降低时，异亮氨酸的产率随之升高，说明玉米浆中溶磷∶有机磷与异亮氨酸的产量成负相关。

表2 不同批次的玉米浆发酵产酸表（单位：g/100 mL）

2.2 不同含量的无机磷对产酸的影响

由于5个不同批次的玉米浆样本中可能还存在其他影响产酸的因素，因此为了减少影响因素并进一步探究无机磷对异亮氨酸产率的影响，设计了不同浓度无机磷（磷酸二氢钾）添加实验。实验中选取产酸最高的样本3作为玉米浆来源。实验结果（表3）显示：当无机磷添加量为0（无机磷∶玉米浆干基）时，异亮氨酸的产率最高，为3.012 g/100 mL；当无机磷添加量达到0.40%时异亮氨酸的产率最低，为1.872 g/100 mL。 并且随着无机磷的添加，玉米浆中总磷∶玉米浆干基的比例逐渐上升，异亮氨酸的产率逐渐降低，成负相关。其中，当总无机磷∶总有机磷在77%以下时，异亮氨酸的产率较高。

表3 玉米浆中添加无机磷后的发酵产酸表

2.3 不同含量的有机磷对产酸的影响

为了进一步探究有机磷的含量对异亮氨酸产率的影响，设计了不同浓度的有机磷（菲汀）添加实验。实验结果（表4）显示当玉米浆中有机磷的添加量在0%～0.2%（有机磷∶玉米浆干基）时，异亮氨酸的产酸量逐渐上升，且添加量在0.2%时产酸达到峰值， 2.951 g/100 mL；当进一步增大有机磷的添加量，异亮氨酸的产率则逐渐降低。因此在玉米浆中添加少量的无机磷能够在一定程度上促进异亮氨酸的产酸量，并且添加0.2%的有机磷，即总无机磷∶总有机磷为66.71%时是最佳的有机磷添加量。

表4 玉米浆中添加有机磷的发酵产酸表

3 讨论

磷是微生物生长繁殖和合成代谢产物所必需的成分。贾志伟[7]研究了磷配比对抗生素发酵的影响，显示出配比的重要性。刘鹏等[13]在对红霉素发酵工艺的研究中发现磷元素能够影响菌丝生长，进而影响发酵效价。通过对不同玉米浆批次自身含有的磷元素的测定（表1），实验结果显示不同批次的玉米浆中磷元素的含量也不一致，这可能是受到原料玉米的质量、生长环境等因素的影响。在不同批次玉米浆对异亮氨酸产酸量的影响实验中（表2）发现当玉米浆中的溶磷∶有机磷的值降低时，异亮氨酸的产率随之升高，说明玉米浆中溶磷∶有机磷与异亮氨酸的产量成负相关。其中样本3的溶磷∶有机磷最低，其产酸也最高。因此，在玉米浆的采购过程中，可以将磷元素含量作为玉米浆质量的重要考察指标，选择发酵用玉米浆中磷含量以2%～3%（干基）较好，其中含有的溶磷∶有机磷的比值较低更适合用于异亮氨酸的发酵。

无机磷源主要是磷酸盐的化合物，如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等。因此，研究中以磷酸二氢钾作为原料进行了玉米浆中无机磷的添加。实验结果显示（表3）随着无机磷的添加，玉米浆中总磷∶干基的比例逐渐上升，异亮氨酸的产率逐渐降低，二者成负相关。其中，当总无机磷∶总有机磷在77%以下时，异亮氨酸的产率较高。因此，在异亮氨酸的发酵过程中，当玉米浆自身含有的无机磷元素较高时，可以减少甚至不添加无机磷，将总无机磷∶总有机磷的值维持在77%以下时有利于异亮氨酸的发酵与产率。

玉米浆中的有机磷是以菲汀（植酸钙镁或植酸钙）的形式存在，有的玉米淀粉厂先从玉米浆中提出菲汀后再用菲汀滤液蒸发浓缩制成玉米浆，实际上是去除了有机磷，不利于发酵。因此，在发酵过程中可以适当添加一定的有机磷元素，促进发酵的产率。有机磷添加实验结果显示（表4），在玉米浆中添加少量的无机磷能够在一定程度上促进异亮氨酸的产率，并且添加0.2%的有机磷，即总无机磷∶总有机磷为66.7%时是最佳的有机磷添加量。因此，在异亮氨酸的发酵配料过程中，应注意检测培养基中的无机磷∶有机磷的值，将其维持在66.7%左右，这将在一定程度上促进异亮氨酸的产率。

4 结论

本研究从5个批次的玉米浆出发，对其本身含有的无机磷和有机磷元素进行了测定，并进行了发酵实验验证其对异亮氨酸产率的影响。在筛选出了一个产酸最高的玉米浆批次后又进行了无机磷与有机磷的添加实验。实验结果显示，当玉米浆中的总无机磷∶总有机磷为60%～70%时最佳，当超出这一范围时应当在发酵培养基中添加无机磷或有机磷元素，从而提高异亮氨酸的产率。这将指导在异亮氨酸的发酵生产过程中玉米浆的选择与采购。

由于玉米浆中所含元素过多，对发酵的影响因素也不仅仅局限于磷元素的含量，因此未来还可以进一步对玉米浆中各类元素进行研究，以求找到最适用于异亮氨酸发酵的玉米浆指标。同时，不同的菌种所需要的磷元素的含量也存在一定的差异。本研究只针对特定异亮氨酸生产菌种进行了研究，因此未来还可以针对不同的菌种进行磷元素含量的影响研究。