刘小兵，施育华

（南通大学第六附属医院/盐城市第三人民医院普外科，江苏 224001）

全球每年大约新增100万胃癌患者，尽管近年来胃癌诊治水平有很大提高，但仍然是癌症死亡的第三大原因[1-3]。microRNA（miRNA）为小型保守非编码RNA，长度约18～24个核苷酸[4]，通过与目标mRNA 3′-非翻译区（3′-UTR）绑定，导致mRNA降解和翻译抑制[4-5]。有研究表明，miRNA可能是胃癌潜在的治疗靶点[5]，miRNA参与肿瘤的发生或抑制[6]。miR-4513是最新发现的miRNA，据报道与人类某些疾病的进展有关[7]。研究发现，rs2168518:G＞miR-4513的多态性增加肺腺癌细胞对吉非替尼的反应[8]。本研究选取2015年7月—2021年7月在我科行胃癌根治术41例患者的手术标本，以及胃癌细胞系HGC27和MGC803，分析胃癌组织及胃癌细胞系中miR-451 3的表达及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 标本及主要试剂 行胃癌根治术患者41例，其中男性24例，女性17例，年龄43～79岁，平均65±2.3岁，术前均未接受过放化疗等治疗。术后标本病理诊断均为腺癌，取距离癌缘＞5 cm组织为癌旁组织。所有标本离体后立即储存在液氮中待检。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书。胃癌细胞系（HGC27和MGC803）及正常胃粘膜上皮细胞（GES）（南京斯琼格尔生物科技研发中心），加入含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素G和100 mg/mL链霉素的RPMI 1640培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。Trizol试剂、PCR扩增试剂盒、2×EasyTaq PCR SuperMix、内参U6及miR-4513特异RT-PCR引物（南京斯琼格尔生物科技研发中心），DNA marker、5×TBE缓冲液（上海生工生物工程有限公司）。

1.2 miR-4513 mRNA检测 使用Trizol试剂提取胃癌组织、癌旁组织、胃癌细胞及正常胃粘膜上皮细胞总RNA，逆转录合成cDNA，采用实时定量PCR法检测miR-4513 mRNA。引物序列:miR-4513:F:5′-ACACTCCAGCTGGGAGACTGACGGCTGGAG-3′，R:5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGATGGGC-3′；U6 snRNA:F:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3，R:，5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。扩增条件:95℃10 s、57℃20 s、72℃15 s，40个周期。以U6 snRNA为内参，设3个复孔，取均值。ΔCt=[Ct（miR-4513）-Ct（U6）]，计算miR-4513mRNA相对表达量。

1.3 统计学处理 应用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析。计数资料以频数表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以±s表示，组间比较采用配对t检验；Pearson法进行相关性分析，COX回归模型分析影响患者生存期的因素，Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存期比较采用log-rank检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-4513在胃癌细胞及组织中的表达 HGC27和MGC803胃癌细胞miR-4513 mRNA表达显著高于正常胃粘膜上皮细胞，胃癌组织中miR-4513 mRNA的表达显著高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P＜0.01），表明miR-4513是胃癌的癌基因。见图1A、1B。

图1 miR-4513在胃癌细胞及胃癌组织中的表达

2.2 miR-4513表达与胃癌患者临床病理特征的关系 miR-4513 mRNA表达与TNM分期、淋巴结转移及远处转移有关（P＜0.05），而与性别、年龄及肿瘤大小无关（P＞0.05）。见表1。COX回归模型多因素分析显示miR-4513 mRNA可作为独立的生存预后因子。见表2。

表1 miR-4513表达与胃癌临床病理特征的关系

表2 影响胃癌患者生存预后的多因素分析

2.3 miR-4513表达与患者生存率的关系 对41例胃癌患者采用门诊或电话方式进行术后随访，随访时间18～72个月，中位随访时间32个月。生存时间为从手术之日开始至死亡或末次随访时间。miR-4513高表达组总生存率低于低表达组，差异有统计学意义（P＜0.001）。见图2。

图2 miR-4513不同表达患者的生存率曲线

3 讨 论

胃癌是我国常见的癌症，每年病亡人数居世界首位。我国年轻胃癌患者数量呈逐年增高趋势。早期胃癌漏诊、误诊率高达27%，通常确诊时肿瘤分期已偏晚，严重影响患者的预后。因此，胃癌早期识别非常重要，需要不断深入了解胃癌发生发展的机制，寻找治疗新的分子靶点。很多研究表明，miRNAs参与胃癌发生发展进程。有研究发现，胃癌组织和血清中miR-632表达增加，miR-632通过Trefoil因子1加速血管生成，从而促进胃癌的进展，表明miR-632具有致癌作用[10]。miR-1254在体外抑制胃癌细胞的增殖、迁徙、侵袭，在体内通过靶向Smad泛素调节因子1抑制肿瘤发生。

本研究结果显示，HGC27和MGC803胃癌细胞中miR-4513 mRNA的表达显著高于GES正常胃粘膜上皮细胞，胃癌组织中miR-4513 mRNA的表达显著高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P＜0.01）。miR-4513 mRNA表达与TNM分期、淋巴结转移及远处转移有关（P＜0.05）。多因素分析显示miR-4513 mRNA可作为独立的生存预后因子，miR-4513高表达组总生存率低于低表达组，差异有统计学意义（P＜0.001）。提示miR-4513可能在胃癌的发生发展中具有一定的促进作用，miR-4513高表达患者可能预后不良。