陈颖颖，唐 翀

（南通大学第二附属医院/南通市第一人民医院1呼吸内科；2普外科，江苏 226001）

肺癌是常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的主要原因，2018年全球约有177万肺癌患者死亡[1]。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌的80%[2]，目前治疗包括手术、化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗[3]，但大多数患者诊断时已处于中晚期，5年生存率低于20%[4]。因此，寻找新的生物标志物和治疗靶点尤为重要。

MicroRNA（miRNA）是一段内源性非编码单链RNA小分子，通过与靶基因3’非翻译区（3’-UTR）完全或不完全互补结合而降解靶基因mRNA，调控靶基因水平，进而影响细胞生物学过程[5]。一个miRNA可以调控多个靶基因，一个基因也可以被多个miRNA调控，预测超过60%的人类基因受miRNAs调控。miRNA在多种肿瘤中差异表达，在肿瘤发生发展中发挥重要的调控作用[6]。越来越多的研究发现，miRNA与NSCLC的发生发展及转移密切相关，miR-320a在NSCLC中表达下调，并可作为直接靶向NSCLC细胞的肿瘤抑制因子[7-8]。泛素连接酶Pirh2（p53-induced RING-H2 protein）是一种具有内在泛素连接酶活性，促使底物蛋白发生泛素化修饰的结合蛋白，影响NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学过程[9-10]。生物信息学分析发现Pirh2可能是miR-320a靶基因，但miR-320a是否靶向调控NSCLC中Pirh2蛋白，从而参与细胞增殖、侵袭和迁移仍不清楚。本研究选择2020年1月—12月于我院行NSCLC根治手术的20对癌组织和癌旁组织标本以及人NSCLC细胞系，旨在探究miR-320a靶向Pirh2对NSCLC细胞增殖和迁移的调控作用。

1 资料与方法

1.1 组织标本 NSCLC根治手术的20对癌组织及癌旁组织标本，均经病理学检查确认，在手术后立即储存在液氮中。本研究经本院伦理委员会批准。

1.2 人NSCLC细胞系 人NSCLC细胞系（H1299、A549、SPCA1、H460、Calu1）和正常支气管上皮细胞株（16HBE）购自美国ATCC公司，采用含10%胎牛血清，链霉素（50μg/mL）和青霉素（50 U/mL）的RPMI-1640培养基，于5%CO2，37℃培养箱中培养。

1.3 细胞转染 待A549细胞生长至80%融合度，以适当密度接种至6孔板中。按转染质粒的不同分为6组:NC mimics组、miR-320a mimics组、NC组（转染si-NC）、si-Pirh2组（转染si-Pirh2）、miR-320a mimics+NC组（共转染miR-320amimics和pcDNA3.1）、miR-320a mimics+Pirh2组（共转染miR-320a mimics和pcDNA3.1-Pirh2）。按照LipofectamineTM 2000转染试剂使用说明进行转染，48 h后采用qRT-PCR检测转染效果，蛋白质印迹法（Western blot）测定Pirh2蛋白表达情况。

1.4 荧光实时定量PCR 采用Trizol（Invitrogen公司）提取细胞RNA，反转录试剂盒（TaKaRa公司）逆转录cDNA，TaqMan MicroRNA试剂盒检测miR-320a表达水平，以U6作为内参，2-ΔΔCt进行定量。实验重复3次。

1.5 Western blot检测Pirh2蛋白表达 提取转染细胞总蛋白，采用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。经沸水浴变性后，取20μg蛋白上样至12%SDS-PAGE凝胶电泳。电压80 V，当Marker跑至分离胶与浓缩胶交界处，换至120 V电压。采用湿转法将蛋白凝胶转至PVDF膜。将PVDF膜置于含5%脱脂牛奶中室温下封闭2 h，TBST洗膜，加入一抗，置于4℃冰箱过夜。洗膜，5 min×3次，加入二抗，室温避光孵育2 h，洗膜，5 min×3次。显影。

1.6 CCK-8细胞增殖试验 96孔板中加入100μL细胞悬液，在培养箱中预培养24 h。向培养板加入10μL不同转染质粒的A549细胞，孵育24 h、48 h、72 h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，培养箱内孵育1～4 h，采用酶标仪检测各组细胞在490 nm波长处的吸光度值。实验重复3次，取均值。

1.7 克隆形成实验 将转染的NSCLC细胞以合适密度接种在6孔板中，培养2～3周。PBS洗涤2次，多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色，计数大于2 mm的克隆数目。

1.8 Transwell实验 迁移实验:待测细胞培养至对数生长期，消化细胞，用无血清培养基悬浮细胞，将104个细胞加到Transwell上室，下室加入600～800μL DMEM培养基，置于培养箱中孵育24 h。弃去上室中培养基，加入甲醇室温固定30 min。吸干固定液，加入染液染色15～30 min。清水冲洗浸泡数次，吸去上室液体，棉签擦除未穿过的细胞，中性树胶封片。显微镜下随机选取9个视野观察，计算穿膜细胞数。侵袭实验:按1∶2比例将基质胶与无血清DMEM培养基混匀，包被Transwell上室，将104个细胞加入Transwell上室，其余操作同迁移实验。

1.9 荧光素酶报告基因实验 将A549细胞接种于24孔板，使用Lipofectamine 2000将构建好的野生型Pirh2-3′-UTR-WT和突变型Pirh2-3′-UTRMUT的荧光素酶报告质粒及NC mimics、miR-320a mimics转染至A549细胞中，转染48 h后，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒操作步骤检测各组细胞荧光素酶活性。实验重复3次，取均值。

1.10 统计学处理 应用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析。计量资料以±s表示，组间差异性比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 人NSCLC癌组织和细胞株中miRNA-320a表达水平下调 荧光实时定量PCR检测显示，与癌旁组织相比，20例人NSCLC癌组织中miR-320a表达显著下调，差异有统计学意义（P＜0.01）（图1A）。与正常支气管上皮细胞株16HBE相比，NSCLC细胞株H1299、A549、SPCA1、H460、Calu1中miR-320a表达显著下调，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），其中A549细胞表达最低，因此在后续实验中作为细胞模型（图1B）。

图1 人NSCLC组织和细胞株miRNA-320a表达水平

2.2 miR-320a过表达抑制A549细胞增殖、迁移和侵袭 将miR-320a mimics和NC mimics转染到A549细胞中，qRT-PCR测定显示，与NC mimics转染细胞相比，miR-320a mimics转染细胞中miR-320a表达显著增加，差异有统计学意义（P＜0.01）（图2A）。CCK-8试验表明，与NC mimics转染细胞相比，miR-320a mimics转染细胞增殖能力明显减弱，差异有统计学意义（P＜0.05或＜0.01）（图2B）。细胞迁移实验表明，miR-320a mimics转染细胞穿过小室基底膜的数目明显少于NC mimics转染细胞，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2C）。细胞侵袭实验的结果类似（图2D）。

图2 A549细胞增殖、迁移和侵袭实验

2.3 miR-320a靶向调控Pirh2表达 TargetScan生物信息学软件预测显示，miR-320a与Pirh2 3'UTR存在结合位点（图3A），推测Pirh2可能是miR-320a的靶基因。荧光素酶报告实验显示，miR-320a mimics显著降低WT-Pirh2 3′UTR的荧光素酶活性，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3B），而对MUT1和MUT2 Pirh2 3′UTR荧光素酶活性无影响，提示miRNA-320a与Pirh2 3′UTR特异性结合，直接调控Pirh2表达。Western blot检测结果显示，miR-320a mimics组细胞中Pirh2蛋白表达水平低于miRNA-NC组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3C），进一步证实miR-320a负向调控Pirh2表达。

图3 荧光素酶活性实验

2.4 Pirh2低表达抑制NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭 将siPirh2#1、siPirh2#2、siPirh2#3和siRNA NC分别转染到A549细胞中，Western blot显示siPirh2#2基因干扰效果最好（图4A，见封二），因此后续实验选择siPirh2#2沉默细胞中Pirh2表达。克隆形成实验表明，与转染siRNA NC细胞相比，转染siPirh2#2的A549细胞增殖能力明显减弱，差异有统计学意义（P＜0.05）（图4B，见封二）。细胞迁移实验表明，转染siPirh2#2的细胞穿过小室基底膜的数目明显少于转染siRNA NC的细胞，差异有统计学意义（P＜0.05）（图4C，见封二）。侵袭实验的结果类似（图4D，见封二）。

图4 Pirh2低表达抑制NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭

2.5 miRNA-320a负调控Pirh2对NSCLC细胞增殖和迁移能力的影响 将miR-320a mimics+pcDNA3.1和miR-320a mimics+pcDNA3.1-Pirh2分别转染到A549细胞中，克隆形成实验和迁移实验表明，与miR-320a mimics+pcDNA3.1转染细胞相比，miR-320a mimics+pcDNA3.1-Pirh2转染的A549细胞增殖能力增强（图5A，见封二），细胞穿过小室基底膜的数目明显增多（图5B，见封二），差异均有统计学意义（P＜0.01），侵袭实验也发现同样现象（图5C，见封二）。

图5 miRNA-320a负调控Pirh2对NSCLC细胞增殖和迁移能力的影响

3 讨 论

NSCLC恶性程度较高，容易复发和转移，多数患者确诊时已处于晚期，目前的治疗方法虽然在一定程度上可减缓病情发展，但如何延长患者的生存期仍需进一步研究[11-12]。先前研究已证明miRNA可能是癌症过程中的关键调节因子[13-14]，了解NSCLC与miRNA异常表达之间的关系有助于寻找新的治疗靶点。本研究发现miR-320a在人NSCLC组织和细胞株中表达下调，证实miR-320a对NSCLC细胞增殖和侵袭的抑制作用以及NSCLC细胞中miR-320a负调控Pirh2的表达。

有文献报道miR-320a是多种肿瘤的抑制因子，与NSCLC关系密切。miR-320a通过靶向电压依赖性阴离子通道蛋白1（VDAC1）影响NSCLC细胞的增殖和侵袭[15]；miR-320a在NSCLC组织中表达下调，并通过直接靶向胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）抑制肿瘤细胞的生长和侵袭[16]；miR-320a-3p/ELF3轴通过PI3K/Akt途径调控NSCLC细胞的转移和侵袭[7]。这些文献均表明miR-320a对靶基因的调控在NSCLC发生发展中发挥重要作用。本研究通过靶基因预测软件检测发现miR-320a与Pirh2 3′-UTR存在互补的核苷酸序列，推测Pirh2可能是miR-320a的潜在靶基因，miR-320a可能通过靶向Pirh2参与NSCLC的发生发展。

Pirh2最早由GRINDEL等[17]发现，由261个氨基酸组成，相对分子质量约为30 kDa，其中包含Rirh-H2结构域，是RING结构域家族的泛素连接酶E3，具有内在泛素连接酶活性，促使底物蛋白发生泛素化修饰[9]。有研究报道，Pirh2促进p53发生泛素化而降解，使p53抑制肿瘤生长的功能减弱或消失，导致肿瘤恶化。有研究发现，Pirh2促进NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭，且与患者低生存率有关[10]。关于miR-320a是否通过调控Pirh2而进一步影响NSCLC细胞的增殖和迁移，目前仍不清楚。本研究荧光素酶报告基因实验显示，miR-320a mimics-WT-Pirh2组细胞荧光素酶活性明显低于miR-320a mimics-MUT-Pirh2组，且miR-320a过表达降低NSCLC细胞中Pirh2的表达，提示miR-320a直接靶向Pirh2的3′UTR。本研究采用siRNA沉默NSCLC细胞中Pirh2表达，导致细胞增殖、迁移及侵袭能力显著降低，而转染pcDNA3.1-Pirh2细胞中Pirh2表达的提高则促进细胞增殖、迁移及侵袭。

综上所述，miR-320a调控NSCLC发生发展的机制十分复杂。本研究发现miR-320a在人NSCLC癌组织和细胞系中表达下调，在体外miR-320a通过下调Pirh2的表达而抑制NSCLC细胞的增殖和迁移，但其下游可能存在的信号通路仍需进一步研究。