李 丹 董凯峰 苏 静 薛海涛 张继华 李天客

头颈鳞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是世界上第六大最常见的癌症，是癌症死亡的主要原因之一，估计每年有60 万人患有HNSCC[1]。HNSCC 包括来自鼻腔、鼻窦、口腔、扁桃体、咽部和喉部的大量肿瘤[2]。其症状主要为口腔溃疡超过2 周不愈，嘴唇、口腔或咽喉有异物感，咀嚼困难或吞咽疼痛，持续鼻塞或鼻出血，颈部肿胀，持续声嘶或声音改变，耳朵无故疼痛，伸舌受限，面部或上颌疼痛，口腔表面黏膜出现白色或者红色异常斑块。然而很少有药物被证明对头颈鳞癌有效。因此，研究头颈鳞癌发生的潜在机制，寻找新的治疗靶点，提高头颈鳞癌患者的临床疗效，是迫切需要解决的问题[3，4]。近年来，人们对头颈鳞癌的发生、发展及治疗的认识已经步入基因层面，关于头颈鳞癌的诊断性新的生物标志物的发现，有助于最大程度提高早期诊断比例和开发新的治疗方法，提高头颈鳞癌患者的生存率和生活质量[5，6]。

甲基转移酶样蛋白14（methyltransferase-like protein 14，METTL14）是2014 年在哺乳动物中新发现的一种甲基转移酶，它可以催化哺乳动物mRNA进行RNA 甲基化修饰（N6-methyladenosine）[7]。n6－甲基腺苷（m6A）于20 世纪70 年代首次发现，它是大多数真核生物中mRNA 和长链非编码RNA（lncRNA）最丰富的内部修饰[8]。m6A 甲基化是一个动态和可逆的修饰，在调控RNA 代谢和生物过程中发挥重要作用[9]。m6A 修饰主要由m6A 甲基转移酶介导，包括METTL14、甲基转移酶样蛋白3（methyltransferase -like protein 3， METTL3）[10]。METTL14 对RNA 结合和复合物稳定起作用[11]，m6A修饰通过m6A 甲基转移酶复合物附着到RNA 上[12]。m6A 被认为是一个新的表观遗传调控层，这一生化过程通过控制RNA 剪接、翻译和稳定性，在调控细胞生长、分化和自我更新中发挥重要作用[13～15]。RNA m6A 修饰在细胞增殖、分化、凋亡等方面具有重要的调控作用[14]。有文献报道，m6A 修饰能够标记pri-miRNAs 分子，并能通过其重要原件METTL14与DGCR8 分子相互作用，参与到pri-miRNAs 的成熟进程中，导致许多生物学过程中miRNAs 的差异表达[16，17]。其中的miR-126 通过下调多个靶基因的表达，参与调控多种信号通路发挥其抑癌基因的功能[18～20]，但其在头颈鳞癌中的表达及研究未见报道。

本研究通过检测METTL14 在头颈鳞癌中的表达水平，探究其在头颈鳞癌发生发展中的作用，从而揭示METTL14 在头颈鳞癌侵袭、转移中发挥的作用机制，评价METTL14 作为预后指标的价值，寻找诊断、治疗靶点，为肿瘤的分子病理诊断和靶向治疗寻找新方向。

资料和方法

1.纳入和排除指标：研究对象为于2015 年8 月至2020 年8 月期间在河北医科大学第一医院和河北医科大学第四医院就诊的79 例头颈鳞癌患者。纳入标准：18～80 岁，本次诊断为头颈鳞癌，并接受手术切除治疗，没有手术史，无放化疗史。排除标准：年龄＜18 岁或＞80 岁，患者及家属不配合，手术耐受差，心肺功能差的患者。本研究经河北医科大学第一医院（批准号：2019017）和河北医科大学第四医院（批准号：2019KY022）伦理委员会批准。所有患者均获得书面知情同意书。

2.临床资料采集：本实验拟采用79 例经手术后，病理证实头颈鳞癌患者的癌组织及癌旁组织、正常组织为研究对象，癌组织为实验组，癌旁组织及正常组织为对照组。将实验组分为有淋巴结转移组及无淋巴结转移组，并根据临床分期，分为Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期。进而对这些临床资料进行分析，探讨METTL14 表达水平的高低对患者生存时间的影响。

3.RT-qPCR：利用qPCR 检测组织中METTL14的mRNA 的表达。提取组织总RNA，NanoDrop2000分光光度计检测RNA 纯度及浓度；DNaseⅠ消化处理及反转录反应合成cDNA，置于-20℃保存；电泳检测RT-qPCR 产物扩增特异性；计算mRNA 相对表达，采用ΔΔCT 方法进行数据处理。

4.免疫组织化学染色：石蜡包埋、切片，4%多聚甲醛固定头颈鳞癌和癌旁组织20 min，PBS（PH7.4）洗涤（3 次，5 min/次）后置于含EDTA（PH9.0）抗原修复液（Servicebio G1203，武汉，中国）的修复盒内进行抗原修复，后用3%双氧水溶液于室温避光孵育25 分钟以阻断内源性过氧化物酶，之后3% BSA于室温封闭30 分钟。轻轻甩掉封闭液，于切片上滴加METTL14 抗体（稀释比＝1：1000，26158-1-AP，Proteintech，Rosemont，USA），湿盒内4℃孵育过夜。PBS 洗涤（3 次，5 分钟/次），稍甩干切片，滴加与一抗相应种属的HRP 标记的第二抗体，于室温孵育50 分钟。然后用新鲜配置的DAB 显色液进行显色，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。苏木素复染3 分钟，苏木素分化液分化数秒，苏木素返蓝液返蓝，分别流水冲洗进行细胞核复染。不同梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。最后显微镜镜检，采集图像分析。最终切片内细胞核为蓝色，DAB 显色阳性为棕黄色。

5.统计学：数据以占总数的百分比表示。采用皮尔逊卡方检验、斯皮尔曼相关性检验、单因素和多因素cox 回归分析，分别分析临床参数与METTL14 基因表达水平之间的相关性以及通过计算风险比（HRs）和95%置信区间（95% CI）分析相关参数与METTL14 的关联性。所有统计分析均使用SPSS 软件21.0 进行（IBM Corp.，Armonk，NY，USA），以P＜0.05 差异有统计学意义。

结 果

1.皮尔逊卡方检验分析：表1 根据皮尔逊卡方检验结果计算了各个临床因素与METTL14 表达之间的关系。在受试个体中，淋巴转移（P＝0.016）和生存时间（P＜0.001）与METTL14 表达显著相关。然而，性别（P＝0.579）、年龄（P＝0.581）、肿瘤直径（P＝0.562）、TNM 分期（P＝0.581）与METTL14 表达水平无显著相关性（表1）。

表1 头颈鳞癌患者的相关临床特征及与METTL14 的关系

2.斯皮尔曼相关性分析：我们运用斯皮尔曼相关性分析进一步确定各个临床特征是否与METTL14 表达水平有重要相关性。斯皮尔曼相关系数显示淋巴转移（ρ＝-0.271，P＝0.016）和生存时间（ρ＝-0.747，P＜0.001）与METTL14 显著相关。然而，性别（ρ＝-0.062，P＝0.585）、年龄（ρ＝0.062，P＝0.587）、肿瘤直径（ρ＝0.065，P＝0.568）、TNM 分期（ρ＝0.062，P＝0.587）和METTL14 表达之间没有关联性（表2）。

表2 头颈鳞癌患者特征与METTL14 表达水平的关系

3.单因素cox 回归分析：同时，我们使用单变量cox 回归分析来确定相关参数与生存时间、风险比（HRs）和95%置信区间（95% CI）之间的联系。表3用单因素cox 回归描述了研究对象在单变量水平上的HRs 和95% CI，并得出METTL14 表达水平（HR＝27.972，95% CI:9.609-81.430，P＜0.001）与患者的生存时间有明显相关性（图1）。但生存时间与性别（HR＝1.158，95% CI：0.711-1.886，P＝0.555）、年龄（HR＝1.199，95% CI：0.728-1.975，P＝0.476）、肿瘤直径（HR＝1.701，95% CI:0.878-3.293，P＝0.115）、TNM 分期（HR＝0.965，95% CI：0.586-1.588，P＝0.888）、淋巴转移（HR＝0.643，95% CI：0.383-1.077，P＝0.093）之间无显著相关性（表3）。

图1 METTL14 基因表达水平与头颈鳞癌患者生存时间关系的生存曲线图

表3 单因素cox 回归分析METTL14 对头颈鳞癌患者生存时间的影响

4.多因素cox 回归分析：为了有效控制混杂因素的影响，将所有因素同时纳入多变量cox 回归模型。表4 显示了多变量cox 比例回归分析的结果，其中METTL14 表达水平（HR＝30.508，95% CI：10.059-92.531，P＜0.001）与患者的生存时间有明显相关性。但性别（HR＝1.283，95% CI:0.771-2.135，P＝0.337）、年龄（HR＝0.985，95% CI: 0.567-1.711，P＝0.958）、肿瘤直径（HR＝1.879，95% CI:0.902-3.917，P＝0.092）、TNM 分期（HR＝0.911，95% CI:0.610-1.961，P＝0.763）、淋巴转移（HR＝1.094，95% CI: 0.610-1.961，P＝0.763）与生存时间无显著相关性（表4）。

表4 多因素cox 回归分析METTL14 对头颈鳞癌患者生存时间的影响

5.基于免疫组化技术，METTL14 在头颈鳞癌中高表达：通过免疫组化半定量分析结果显示，与癌旁组织对比，METTL14 在头颈鳞癌组织中呈现高表达（P＜0.05，见图2）。

图2 （A）免疫组化显示METTL14 在头颈鳞癌中的表达情况，黄色代表METTL14 的表达。（B）METTL14 在头颈鳞癌中高表达。*表示P＜0.05

讨 论

头颈鳞癌是一种侵袭性肿瘤，具有明显的淋巴结趋向性[21，23]。本研究通过皮尔逊卡方检验、斯皮尔曼相关性分析及cox 回归分析证明：METTL14 基因存在促进头颈鳞癌细胞的增殖作用，其表达水平越高，头颈鳞癌患者的生存时间越短。

METTL14 是一种蛋白质编码基因，形成n6-甲基转移酶复合物的一部分，使mRNA 甲基化，可以调节胚胎干细胞分化、DNA 损伤修复和肿瘤的发生。肿瘤的发生是一个与许多肿瘤抑制基因和癌基因相关的协同过程，在肿瘤发生中诱导表观遗传改变。n6-甲基腺苷RNA 甲基化是信使RNA（mRNAs）最普遍的修饰方式，由多组分甲基转移酶复合物催化，其中METTL14 是一个核心分子[24]，抑制METTL14的表达可降低m6A 水平[25]，METTL14 的高表达可以使m6A 甲基化。m6A 修饰是一个综合的、与环境相关的生物过程[26]。m6A 在多种病理生理过程中发挥关键作用。甲基化酶可以以m6A 依赖性的方式促进成熟miRNA 的加工，从而参与病理过程的发生发展。如果m6A 修饰的转录本与不同的m6A 结合蛋白结合，就会发生不同的结局[24]。METTL14 在结构稳定和RNA 底物识别中起作用，也可以调节n6-甲基腺苷依赖的初级miRNA 加工[17，27]。METTL14 在多种恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用，n6-甲基腺苷RNA 甲基化与多种恶性肿瘤进展相关[28]。METTL14 高表达的宫颈癌患者生存时间较短[29]。且与神经母细胞瘤患者低生存率显著相关[30]。METTL14 通过m6A 修饰调控其mRNA 靶点来发挥其致癌作用[12]。大约70%的子宫内膜肿瘤表现出m6A 甲基化的减少是由于METTL14 突变激活AKT通路[31]。Sun 等证实LNC942 基因可以促进METTL14介导的m6A 甲基化，在乳腺癌的发生和发展过程中发挥重要作用[32]。同时，METTL14 还可以通过mRNA m6A 修饰抑制造血干/祖细胞分化，促进白血病发生[12]。METTL14 能显著促进胶质母细胞瘤干细胞的生长、自我更新和肿瘤发生[33]。m6A 的降低会增加癌细胞中目标转录本的表达，导致血管生成和肿瘤生长发展[34]。同时，m6A 修饰可以结合DGCR8，阻断miR-126 的成熟，进而激活PI3K/AKT/mTOR通路，促进肺纤维形成[35]。miR-126 已被证实在大部分肿瘤组织中呈现低表达，并且与肿瘤的发生、发展呈负相关[36]，在肿瘤的诊断、治疗及预后判断等方面具有潜在价值，而METTL14 可能调控miR-126 影响pri-miRNAs。miRNA 可以作为癌基因或抑癌基因，促进或抑制癌症，这使得它们成为癌症分子治疗的重要靶点。

本研究通过检测METTL14 在头颈鳞癌中的表达水平，进一步证实METTL14 在头颈鳞癌发生发展中发挥了促进头颈鳞癌细胞的增殖的作用，且可能作为预后指标，为头颈鳞癌的早期诊断及治疗提供新靶点。