张利娜，杜相欣，张雨彤，郭 霞，郝 娜，赵 欣，张 宇

(山西医科大学生理学系 细胞生理学教育部重点实验室，太原 030001)

脑机接口(brain computer interface，BCI)可独立于机体的外周神经和肌肉将大脑神经网络产生的信号传送至电脑设备并与之互通交换[1]。BCI作为临床康复治疗的重要手段之一，已广泛应用于神经假肢[2,3]、疼痛缓解[4,5]、帕金森症抑制[6-8]、视觉恢复[1,9]等领域。脑机接口的连接方式有植入式和非植入式之分[10]，其中植入式具有时空分辨率高、定位精准、记录信号质量好等优势[11]。植入式脑机接口通过手术的方式将微丝电极阵列、硅电极阵列和光电极等神经微电极植入至具体目标脑区[11,12]，以实现对电极记录点周围神经元放电信号的直接采集和记录。

微丝电极阵列(microwire electrode array,MWEA)作为BCI的重要媒介之一，因其高通量记录[12-14]、耗材便宜、制作简单、性能稳定[11]等特点被广泛应用于多通道电生理等基础实验研究。MWEA一般采用直径为20～50 μm的被一层绝缘材料包裹的金属丝制成[9]，这些金属丝主要包括镍铬合金、铂铱合金、钨、铂和不锈钢等[11,15]。常规电生理实验一般选用导电性能、物理机械性能、电化学性能和制作成本均较为优异的镍铬合金丝作为制作微丝电极的材料[9,11]。微丝电极的发展历史悠久，早在1950年，已有人制作出金属微丝电极并用于神经电信号的记录[16]，此时的单根金属电极并不能满足科学家对大脑8×1011神经元的探索与研究，因此，科研人员逐渐研制出多根电极丝排列的MWEA。Tsai等人[17]制备的16和32通道的微丝电极阵列为脑神经网络的多通道电生理研究提供了坚实的媒介支撑，也是目前电生理实验广泛使用的微丝电极阵列原始模板[18]。虽然MWEA在记录神经元放电方面有诸多优势，但是其记录到的电信号存在信噪比低、电压幅度小，且易受被记录对象的运动干扰等缺点。实验中，可以通过适当增加电极尖端的表面积(如在尖端电镀修饰材料)来减小电极阻抗，但是阻抗过小会增加背景噪音，降低信噪比[9]。连接地线可降低一部分噪音干扰，提高记录信号的信噪比，但是这种排噪方式比较随机，个体差异较大。目前在多通道电生理实验中，商品化的微丝电极阵列已经逐步进入市场，但由于其高昂的价格，并不适用于大多数实验室。实验中，常常通过修正地线连接的部位找到排干扰的最佳方式，但效果并不理想，在此背景下，优化微丝电极的制作无疑成为最便利实惠的途径。我们之前的实验经验提示，制作合适的参考电极可适当降低实验对象运动过程中产生的高频干扰，提高信噪比，但是具体的制作方法和实验效果并没有经过系统的对比。

基于此，本实验室聚焦于参考电极的改良，从而优化微丝电极阵列的制作，致力于记录到比较理想的锋电位(Spike)或动作电位(action potential,AP)，这也是多通道电生理学研究面临的挑战之一。针对这一难题，我们通过将参考电极内置或外置，同时自制内置参考和外置参考微丝电极阵列，对比研究以探寻出稳定排噪、高信噪比和抗环境干扰、高放电幅度的微丝电极阵列，为在体多通道电生理研究和脑机接口提供更可靠的植入桥梁。

1 材料与方法

1.1 实验动物

购自北京斯贝福生物技术有限公司200～250 g的雄性SD大鼠，饲养在山西医科大学生理学系SPF级实验动物饲养室，温度：22～24℃，12/12 h昼夜循坏光照，食物充足、随意饮水。电极埋置术前3～4只/笼饲养，术后1～2只/笼饲养。术后腹腔注射青霉素(2×105U)。动物随机分内置参考电极组和外置参考电极组，术后一周连续检测体重，剔除体重降低或增加不明显、电极脱落或松动的大鼠，最终内置参考电极组(内置组)8只、外置参考电极组(外置组)9只。所有动物实验及处理均经山西医科大学伦理委员会审核批准。

1.2 实验试剂与器材

制备电极耗材：镍铬合金丝、电路板、电极引脚、地线(Samtec)，AB胶(哥俩好)，1∶1搅拌混匀，Crazy胶，显微镜、冷光源、电烙铁。

手术过程用品：1%戊巴比妥钠(45 mg/kg)，手术器械(眼科剪、镊子、碘伏、棉签)，颅骨钻、颅骨钉(长2 mm，直径1 mm)、液体石蜡，牙托水凝和牙托水(1∶1混合)，青霉素(2×105U)，大鼠脑立定位仪(NARISHIGE，JAPAN)。

BlackRock多通道记录设备及Cerebus记录系统及数据分选分析系统：

Cerebus(BlackRock，USA)，Central(BlackrRock,USA)，Offline Sorter3(Plexon，USA)，NeuroExplorer4(neuroexplorer，USA)。

1.3 微丝电极阵列制作过程

(1)Samtec接口的针脚对准电路板的铜片(图1a-1)，首先用焊锡固定电极两侧边端(图1a-2)，再逐步粘合其余接口，相邻接口之间的焊锡不能接触，以免发生短路(电极另一侧同样操作)；(2)将电极丝剪成200 mm左右的小段；(3)摆排电极丝(图1a-4)，将剪好的电极丝并列摆放在电路板上,共8根，两两间隔200 μm左右；(4)剥掉绝缘层，用镊子或电烙铁刮掉电极丝外层包裹的绝缘层，暴露出镍铬合金电极导电部分；(5)将剥掉绝缘层的电极端插入已被焊锡焊接的Samtec接口与电路板的铜片之间(图1a-5)。

Fig. 1 Schematic diagram of microwire electrode array and amplifier adapter

制作电极另一侧，重上述2-5步骤；焊接地线，内置参考电极(图2a)：在电极一侧的任意一端焊接一根银丝作为地线，将剥掉一部分绝缘层的排列在电极阵列最外侧的电极丝作为参考电极，焊接到电极另一端；外置参考电极(图2b)：在电极一侧的两端焊接两根银丝，一根作为地线，另一根作为参考电极，在下置电极时，两根电极均缠绕在颅骨钉上；AB胶1∶1混合粘粘电极引脚针脚与电路板衔接处(图2c,2d)，一方面起到绝缘的作用，另一方面可保护裸露在外面的电极丝；在手术前，用眼科剪减掉电路板多余的部分，如图1a中红色“×”所示；根据目标脑区的定位，剪断电极丝(图1a)，剩余电极丝应长出目标脑区深度1～2 mm。

1.4 电极埋置手术

称重：200～250 g的SD雄性大鼠；麻醉：45 mg/kg 的1%戊巴比妥钠，腹腔注射；剃毛、碘伏消毒和剪皮；棉签擦除粘膜和结缔组织，暴露颅骨；定位：脑立体定位仪确定目标脑区前扣带皮层(anterior cingulate cortex,ACC)的范围(图3)；颅骨钉固定、开颅窗；夹持电极、将外置参考电极的地线和参考电极绕在已固定好的两个颅骨钉上(图3)，不少于10圈；内置参考电极的地线绕在同侧颅骨钉上，参考电极同微丝阵列一并植入至ACC脑区，电极植入速度1 μm/s、牙托水凝固定；苏醒后放回鼠笼单独或两只一笼饲养，腹腔每天注射2×105U的青霉素，以防感染。

Fig. 2 Self-made microwire electrode array with built-in and external reference electrode

Fig. 3 The map of ACC location

1.5 多通道电生理记录

术后监测大鼠体重变化，7 d后挑选体重稳定增长、脑部电极无松动、无脱落的健康大鼠进行多通道电生理检测，连接多通道记录系统(图4)，分别记录内置和外置参考电极组大鼠ACC脑区神经元放电情况，并对比观察。

使用BlackRock公司的Cerebus系统实时记录大鼠ACC神经元的锋电位(spike)或动作电位(action potential,AP)。Central软件用于实时记录，设置采样率为1 kS/s，场电位滤波为低频250 Hz，动作电位或峰电位(Spike)参数为神经元特有的BP 250 Hz～5 kHz；Offline Sorter3软件用于分选动作电位，可过滤掉实时记录到的意外噪音，根据神经元放电特征和差异，用主成分分析法筛选出每个记录通道不同神经元的放电类型；NeuroExplorer4软件用于导出放电图谱和统计数据，经Sorter之后的数据导入NeuroExplorer可直观不同通道不同神经元放电频率和对应的原始图谱。

Fig. 4 Schematic diagram of a multi-channel electrophysiological connection device

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 两种电极记录到的大鼠ACC脑区的神经元放电情况

电极埋置一周后，将大鼠放在可自由活动的用锡箔纸包裹的屏蔽箱内(排除干扰)，记录大鼠自由活动时ACC脑区神经元的放电活动。内置和外置参考电极组大鼠均可记录到ACC的神经元放电信号(图5)，证明两种电极被成功制作。

Fig. 5 Neuron firings recorded by microwire electrode array with built-in and external reference electrode

2.2 两种电极记录到的大鼠ACC脑区神经元的放电信噪比情况

信噪比可显示出混在背景噪音里的神经元实际的放电信号[12]。在多通道电生理记录中，最常使用连接地线的方法排除环境和自身运动干扰，或者采用不同直径的电极丝来适当降低阻抗，但在特定直径的电极耗材和无法完全杜绝环境噪音的情况下，记录到大鼠神经元放电的信噪比还不能达到理想的目标，尤其是面对实验对象自由活动这一难题。

此实验分别使用内置或外置参考电极的微丝电极阵列，通过对比观察，内置组大鼠的Spike放电信噪比均显著高于外置组(内置vs外置：4.738± 0.368vs2.878±0.434，n=8)，P<0.05，图6)。此外，在大鼠自由活动或有不可避免的环境噪音干扰时，内置电极组可显示出较好抗干扰能力，具有较稳定的Spike波形，适合长时间记录；外置电极组神经元电信号则会受大鼠运动和环境噪音的干扰，放电波形不稳定，长时间记录不理想。

Fig. 6 Spike waveform and signal-to-noise ratio statistic graph of built-in and external groups

2.3 两种电极记录到的大鼠ACC脑区神经元的放电幅度情况

实验记录过程中，还发现参考电极内置后记录的放电信号波幅更深，幅度更大。用NeuroExplorer导出原始放电图(图7a-b)后可以明显看到内置组电信号幅度较外置组大，经统计，内置组的波幅为：(0.339±0.014)mv，n=380，外置组波幅为：(0.177±0.008)mv，n=675，两者之间有显著性差异(P<0.05)。

Fig. 7 The original discharge diagram and the statistical results of the amplitude of the built-in and the external groups

2.4 两种电极记录到的大鼠ACC脑区神经元的放电频率情况

虽然上述的实验结果表明，内置或外置微丝电极阵列的参考电极后均能记录到大鼠ACC的神经元放电信号，内置参考电极组大鼠具有更高的信噪比和抗干扰能力，且内置参考电极记录的放电信号具有更大放电幅度。但是应用这两种方法制作的电极是否会影响大鼠脑区的放电频率的记录？为了解决这一疑惑，我们将大鼠的放电频率进行统计和分析，发现两组大鼠的放电频率并没有显著差异(内置vs外置：1.800(1.201，2.625)vs1.700(1.075，2.325)，n=54，P>0.05)，说明内置或外置参考电极的微丝电极阵列均可稳定记录大鼠的放电频率。

3 讨论

多通道电生理技术采用细胞外记录的方法[19]，采集电极记录点附近神经元集群产生的场电位和动作电位(图4-5),虽然细胞外记录采集到的神经元放电波幅仅是细胞内记录的百分之一[15]，但因其操作简易、高通量记录、可长期多次重复测试以及实现实时在体记录等优点[20]而广泛应用于神经科学领域[21,22]。当机体受到外界不同刺激时，应用多通道电生理监测多个脑区神经元群体的放电特征，通过数模转化和集成分析对具体事件的神经元信息进行编码[19]。同时，将已经编码的神经元信号输入至摄像机和人工耳蜗等治疗器械，特异性刺激已受损的神经中枢，从而激活相应核团，实现脑机接口的治疗目的。

微丝电极阵列是多通道电生理技术实现高通量记录必不可少的工具之一，其硬度刚好可以抵抗脑组织产生的阻力，在以一定速度缓慢下降后可顺利到达目标脑区，不会发生弯曲或折断[12]。微丝电极植入特定脑区后，记录到的神经元放电波形和幅度与电极记录点距离神经元胞体的位置、角度等有关[9]；所记录神经元放电信号的质量和信噪比与电极自身的制作及手术过程有关[13]，所以，为了尽可能避免制作手艺带来的困扰，在电极切割时使用钢质剪刀干脆利落的剪断电极丝，减少绝缘层粘连现象，暴露出尽可能多的记录面积以减小阻抗。然而，原始剪刀切割法与新型的微切割[13]方法相比仍是相形见绌，但目前微切割在常规实验室并不普遍。因此，在实验室条件允许的情况下，成熟的地线连接方法和选择适合的参考电极显得格外重要。在多通道电生理实验中，地线通过将实验动物与大地相连接以制造零电势或等电势磁场，达到排除电磁干扰的目的。

参考电极是整个微丝阵列记录电极的参照，以采集到的参考通道里的信号为标准差分计算可得到记录电极的放电情况，即记录通道实际记录信号减去参考通道信号后经放大器输出至电脑显示器端的滤波是最终放电信号，所以，当参考电极内置时，与微丝记录电极一同直接采集脑内神经元放电，具有相同的背景，因此它们所记录数值之间的差异较小，即使受到外界或实验动物自身噪音干扰，差分计算后差值并不会有明显变化。而参考电极外置时，通过颅骨钉间接采集脑神经元的放电，参考通道与记录通道环境差异较大，信号背景差异大且不稳定，更易受外来噪音和自身活动时自身组织放电的干扰。此外，胞外间接记录到的神经元放电波幅是胞内直接记录的1/100左右[15]，类似的，当参考电极内置时，差分得到的记录电极的放电幅度更高，而外置的参考电极由于离记录电极较远，所以记录通道中的放电波幅也就更小。

为了提高微丝电极阵列的记录性能，本实验室同时制备了内置与外置参考电极的微丝电极阵列，通过横纵对比，发现在不影响大鼠放电频率的同时，内置参考电极微丝电极阵列在记录ACC神经元放电过程中有更高的信噪比、优异的抗干扰能力和较大的放电幅度。除此之外，手术方面的注意事项有：第一，清除出血和杂质，保持创面干净；第二，下电极之前绕地线(10圈以上)，以免对电极牵拉影响其位置及电极尖端阻抗；第三，电极下降前期，速度尽可能慢，以1 μm/s为宜，后期可适当增快到2 μm/s，以防电极弯曲，同时可节省时间；第四，在用牙托水凝固定电极前，先在伤口部位涂滴液体石蜡，可减小牙托水凝对创口的刺激；第五，在术后一周之内，每天连接Headstage至少5 min ,使大鼠提前适应记录时的场景和感觉，以防在正式实验时抗拒动作过强。

综上所述，本实验室同时制做了内置和外置参考电极微丝电极阵列，经对比研究发现内置参考电极微丝电极阵列在记录ACC脑区神经元电活动时，信噪比高、背景信号幅度小、抗干扰能力强，放电幅度大，为多通道电生理技术提供更加可靠的工具。