郝礼森，陈盼盼，靳丽敏，展宗媛，杨小师，季景秀，蒋美钰，莫艳波

(华北理工大学附属医院消化内科，河北 唐山 063000)

肝纤维化是各种慢性肝病演变为肝硬化的病理过程，而肝星状细胞 (hepatic stellate cells,HSC) 则是参与此病理过程的最重要细胞，其活化、增殖是肝纤维化形成与发展的重要环节[1-3]。含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶1(SH2 domain-containing protein tyrosine phosphatase 1,SHP1)是一种非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶，最初的研究发现其主要表达于造血细胞，是造血系统的抑癌因子，但进一步的研究发现SHP1在一些非造血细胞如上皮细胞、肝细胞中也有表达，其表达缺失或低表达不仅在造血系统肿瘤的形成及发展中发挥重要作用，也参与一些实体肿瘤及某些非肿瘤性疾病的病理过程[4-6]。在SHP1与肝脏疾病的研究中发现[6,7]，SHP1不仅表达于肝细胞，也表达于HSC，其过表达可通过下调血小板衍生生长因子β信号转导而抑制体外活化肝星状细胞增殖。另有研究显示[8]，SHP1的活性增强可通过负性调控其下游的信号转导子和转录激活子3而促进体外活化肝星状细胞凋亡。但肝纤维病理过程中，SHP1在肝组织及在体HSC的表达与在体肝星状细胞活化及增殖的关系仍不清楚。因此，本研究采用腹腔注射四氯化碳法建立大鼠肝纤维化模型，检测纤维化肝组织及在体HSC的SHP1表达，并探讨其表达变化与在体肝星状细胞活化及增殖的关系，以期为深化探讨肝纤维化发病机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

小鼠抗a-平滑肌肌动蛋白 (alpha-smooth muscle actin,α-SMA)单克隆抗体购于台湾arigo公司，兔抗 SHP1单克隆抗体购于美国BioWorld公司；四甲基异硫氰酸罗丹明标记的山羊抗小鼠IgG及异硫氰酸荧光素标记的山羊抗兔IgG 购于美国KPL公司；Masson染色试剂盒购于北京雷根生物有限公司；SP试剂购于北京中山金桥生物有限公司。

1.2 大鼠肝纤维化模型的构建

50只清洁级健康雄性 SD大鼠(350～400 g)由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。实验过程由华北理工大学实验动物伦理委员会负责审核。所有动物均在实验室按清洁级大鼠要求饲养，自由进食水。采用腹腔注射四氯化碳法构建大鼠肝纤维化模型[9]，50只大鼠被随机分为：对照组(10只)、模型组(40只)。模型组大鼠腹腔注射50%的四氯化碳橄榄油混合液，剂量为1 ml/kg，每周2 次，共8周；对照组大鼠腹腔注射生理盐水，剂量同模型组，每周2 次。在造模后 2周、4周、6周、8周分别取10只模型组大鼠，给予10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，无菌条件下切开大鼠腹腔，切取适量大鼠肝组织，用4%多聚甲醛固定后用于免疫组织化学及HE、Masson三色染色。对照组大鼠肝组织标本同8周模型组大鼠一同留取。

1.3 肝组织病理学及 SHP1和α-SMA免疫组织化学染色检查

大鼠肝组织以4%多聚甲醛溶液固定，石蜡常规包埋并做成5 μm的连续切片，进行HE及Masson三色染色，观察肝组织病理学变化。应用SP法进行SHP1及α-SMA免疫组织化学染色，操作步骤按试剂说明书进行。用PBS代替一抗进行阴性对照染色，染色结果判定为棕褐色代表阳性表达。SHP1及α-SMA免疫组化染色图像应用Image Pro Plus 6.0软件进行分析，平均光密度值 (mean optical density,MOD) 被用于表示SHP1及α-SMA阳性表达水平。

1.4 SHP1与α-SMA免疫荧光双标记检测在体HSC的SHP1表达

常规脱蜡及水化的大鼠肝组织切片经抗原修复、血清封闭，加入兔抗SHP1单克隆抗体(1∶100稀释)及小鼠抗α-SMA 单克隆抗体(1∶100稀释)的一抗，于4℃冰箱中过夜，PBS清洗3次，每次5 min；滴加异硫氰酸荧光素标记的山羊抗兔IgG(1∶100稀释)二抗，37℃恒温箱中孵育30 min，PBS清洗3次，每次5 min；滴加四甲基异硫氰酸罗丹明标记的山羊抗小鼠IgG(1∶200稀释)三抗，37℃恒温箱中内孵育30 min，PBS 清洗3次，每次5 min；滴加DAPI避光孵育10 min染核。阴性对照用PBS代替一抗，其余步骤同上。用激光扫描共聚焦显微镜观察经上述处理的肝组织切片，绿色荧光斑点为SHP1阳性表达，红色荧光斑点为α-SMA阳性表达，黄色荧光斑点为SHP1与α-SMA共表达。由于α-SMA是活化HSC的标志[10]，肝组织中除血管壁平滑肌细胞表达少许α-SMA外只有活化HSC表达α-SMA，故肝组织中表达α-SMA的细胞即可认为是在体活化HSC，SHP1与α-SMA共表达可看做是在体活化HSC的SHP1表达。

1.5统计学处理

2 结果

2.1 大鼠肝组织的病理组织学变化

HE及Masson三色染色显示，在造模过程中，随着造模时间延长，大鼠肝组织的纤维化逐渐加重，造模不同时间均可见不同程度的肝细胞变性坏死而导致正常肝细胞逐渐减少(图1，图2)。该结果表明，四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型构建成功。

Fig. 1 HE staining showed pathological histological changes of rats liver tissues (×200)

Fig. 2 Masson trichrome staining showed histopathological changes of rats liver tissues (×200)

2.2 在体HSC的活化与增殖

α-SMA是HSC活化的标志，肝组织中除活化HSC表达α-SMA外，仅有血管壁平滑肌细胞表达少许α-SMA，故肝组织的α-SMA表达水平可间接反应在体HSC的活化及增殖。大鼠肝组织α-SMA免疫组织化学染色检测结果显示，在对照组大鼠肝组织仅有血管壁平滑肌细胞表达α-SMA，与对照组大鼠肝组织α-SMA阳性表达MOD比较，造模不同时间(2周、4周、6周、8周)大鼠纤维化肝组织的α-SMA阳性表达MOD均明显增加(P<0.05)，且随着造模时间的延长逐渐升高(P<0.05)。上述结果显示，随着大鼠肝纤维化的加重，在体HSC的活化及增殖逐渐加快 (图3，表1)。

Fig. 3 The expressions of α-SMA in rats liver tissues were analyzed through immunohistochemical staining (×400)

Tab. 1 The positive expression MOD levels of α-SMA and SHP1 in liver tissues of rats in each group n=10)

2.3 大鼠纤维化肝组织的SHP1表达

大鼠肝组织SHP1免疫组织化学染色检测显示，SHP1主要表达于细胞浆，与对照组大鼠肝组织的SHP1阳性表达MOD比较，造模不同时间(2周、4周、6周及8周)大鼠纤维化肝组织中SHP1阳性表达MOD均明显增加(P<0.05)，且随着造模时间的延长逐渐升高(P<0.05，图4，表1)。上述结果显示，大鼠肝纤维化病理过程中其肝组织的SHP1表达变化与肝纤维化程度一致，即随着肝纤维化程度的加重而逐渐升高。

Fig. 4 The expressions of SHP1 in rats liver tissues were analyzed through immunohistochemical staining (×400)

2.4 在体HSC的SHP1表达

SHP1与α-SMA免疫荧光双标记检测显示，绿色荧光斑点为SHP1阳性表达，红色荧光斑点为α-SMA阳性表达，黄色荧光斑点为SHP1与α-SMA共表达(肝组织中在体活化HSC的SHP1表达)。对荧光图像进行分析显示，大鼠肝纤维化过程中，伴随肝纤维化的加重，造模不同时间(2周、4周、6周、8周)的大鼠肝组织中表达SHP1的活化HSC占总的活化HSC的百分比(26.49%±3.44%、37.14%±4.57%、44.90%±2.94%、58.09%±5.33%)逐渐升高(P<0.05，图5)。

2.5 SHP1表达与在体HSC活化及增殖的相关性分析

Pearson’s相关性分析显示，不仅大鼠纤维化肝组织的SHP1免疫组织化学染色检测结果与大鼠肝组织的α-SMA免疫组织化学染色检测结果呈显著正相关(r值为0.926,P<0.05)，而且大鼠纤维化肝组织中表达SHP1的活化HSC占总的活化HSC的百分比也与大鼠肝组织的α-SMA免疫组织化学染色检测结果呈显著正相关(r值为0.984,P<0.05)。如上所述，α-SMA是HSC活化的标志，肝组织的α-SMA表达水平可反映在体HSC的活化及增殖。故上述分析结果表明，在四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化病理过程中，纤维化肝组织及在体HSC的SHP1表达变化均与在体HSC的活化及增殖呈显著正相关。

Fig. 5 SHP1 expressions of activated HSC in rats liver tissues was analyzed through Immunofluorescence double-labeling of SHP1 and α-SMA (×400)

3 讨论

SHP1是蛋白酪氨酸磷酸酶家族中的重要成员，表达于造血细胞以及上皮细胞、肝细胞等非造血细胞，是造血系统肿瘤及一些实体肿瘤的抑癌因子[4]。在肝组织中，SHP1不仅在肝细胞中表达并参与肝脏炎症反应的调节[6]，而且也表达于在肝纤维化病理过程中发挥重要作用的肝星状细胞[7]。研究发现SHP1过表达可通过负性调控血小板衍生生长因子β信号转导而抑制体外活化肝星状细胞的增殖[7]；另有研究发现[8,11]，体外活化HSC的SHP1活性增强可通过下调其下游的信号转导子和转录激活子3，从而显著抑制体外活化HSC的增殖，并诱导体外活化HSC凋亡。本研究显示，在大鼠肝纤维化病理过程中肝组织的SHP1表达变化与肝纤维程度一致，即随着肝纤维化的加重而逐渐升高。众所周知，肝脏的主要细胞是肝细胞，而本研究显示在大鼠肝纤维化病理过程中，随着造模时间延长肝纤维化逐渐加重，其肝细胞不断变性坏死而逐渐减少，这与SHP1表达逐渐升高相矛盾。为探讨导致上述结果的原因，本课题组进一步检测大鼠肝纤维化过程中在体活化HSC的SHP1表达变化。由于正常肝脏中的HSC处于静止状态、不表达α-SMA，在肝脏受到损伤时HSC活化为肌成纤维细胞，其表型发生改变，具有较强的增殖能力并表达α-SMA，因此α-SMA被视为活化HSC的标志[3,10,12,13]。本研究应用SHP1与α-SMA免疫荧光双标记检测大鼠纤维化肝组织中在体活化HSC的SHP1表达，结果显示随着肝纤维化程度的逐渐加重大鼠纤维化肝组织中表达SHP1的活化HSC占总的活化HSC的百分比逐渐升高。这提示大鼠肝纤维化病理过程中肝组织的SHP1表达逐渐升高可能与表达SHP1的活化HSC逐渐增多有关。但已有研究发现肝细胞的SHP1参与肝脏炎症反应的调节[6]，而肝纤维化过程中肝脏一直存在炎症反应，纤维化肝组织中SHP1表达升高是否为肝脏炎症反应所致尚需进一步研究。

α-SMA被视为HSC活化的标志，故本研究应用免疫组织化学染色检测大鼠肝组织的α-SMA表达以间接检测在体HSC的活化及增殖。结果显示，随着大鼠肝纤维化的加重纤维化肝组织的α-SMA表达逐渐升高，表明大鼠纤维化肝组织中在体HSC的活化及增殖随着肝纤维化程度的加重而逐渐加快。为探讨大鼠肝纤维化病理过程中SHP1在肝组织及在体肝星状细胞的表达变化与在体肝星状细胞活化和增殖的相关性，本研究分别对大鼠纤维化肝组织的SHP1免疫组织化学染色检测结果和肝组织中表达SHP1的活化HSC占总的活化HSC的百分比与反映在体HSC活化及增殖的肝组织α-SMA免疫组织化学染色检测结果进行Pearson's相关性分析，结果显示无论是大鼠纤维化肝组织还是在体肝星状细胞的SHP1表达均与在体肝星状细胞活化及增殖呈显著正相关。但已有体外研究证实[7]，作为蛋白酪氨酸磷酸酶的SHP1，其过表达可抑制体外活化肝星状细胞的增殖。依此推断大鼠肝纤维化过程中，伴随在体HSC的活化及增殖加快，SHP1在肝组织及在体HSC的表达应逐渐下降而不是逐渐升高。为什么出现上述结果？可能与SHP1的分子构象有关。研究发现[14,15]，SHP1磷酸酶活性的发挥受其分子构象的调控，在无配体结合时SHP1处于自我抑制状态，当酪氨酸磷酸化多肽与其结合后，其构象发生改变、解除抑制状态而活化。且有研究发现SHP1的激动剂如索拉非尼和索拉非尼的衍生物SC-43不仅可通过增强 SHP1的活性抑制体外活化HSC的增殖，并且可通过增强 SHP1的活性减轻胆总管结扎及四氯化碳诱导的小鼠肝纤维[11]。故我们推测，本研究所示大鼠肝纤维过程中肝组织及在体HSC的SHP1表达虽然升高，但其磷酸酶活性并未升高甚至下降，尽管这需要进一步的研究证实。

综上所述，本研究表明大鼠肝纤维化病理过程中其肝组织及在体肝星状细胞的SHP1表达发生了变化，其表达变化不仅与肝纤维化程度一致，而且与在体HSC的活化及增殖呈显著正相关。结合以往相关文献，本研究提示SHP1的上述变化可能通过影响HSC的活化及增殖参与肝纤维化病程，尽管其相关机制尚需进一步研究。