刘书红

（邯郸市中心医院药学部，河北 邯郸 056000）

急性心肌梗死是临床较为常见的急危重症。药物溶栓或经皮冠状动脉介入治疗使血流再通是临床上抢救急性心肌梗死患者的关键[1]。血流再灌注过程常导致心肌的二次损伤，即心肌缺血再灌注损伤，病理生理学研究发现氧化应激、炎症反应与心肌缺血再灌注损伤密切相关。山楂叶总黄酮（hawthorn leaves flavonoids，HLF）是从山楂树叶子中提取的黄酮类化合物，具有良好的抗氧化、抗炎活性[2-3]，研究[4-5]发现HLF 能够通过抑制氧化应激损伤和炎症反应对肺组织、脑组织缺血再灌注损伤起到一定保护作用。蛋白激酶B/核因子E2相关因子2（protein kinase B/Nuclear factor E2 related factor 2，Akt/Nrf2）通路在机体氧化应激和炎症反应中发挥着重要调控作用[6]。本实验通过夹闭左冠状动脉前降支30 min 复制心肌缺血再灌注大鼠模型，以临床治疗心肌缺血再灌注一线用药维拉帕米（Verapami，Ver）作为阳性对照药物，探究HLF 对心肌缺血再灌注后心肌组织病理学改变的影响以及Akt/Nrf2 通路在其中发挥的调控作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠192 只，7 周龄，210 g～240 g，购自河北省实验动物中心[SCXK（冀）2018-004]；实验前适应性饲养1 周，环境设置：室温（25±1）℃，相对湿度（60±5）%，明暗12 h交替，实验前12 h禁食不禁水。本研究经邯郸市中心医院伦理委员会审核批准[批件号：HDZXLL（K）字2020-036]。

1.2 药物与试剂 HLF 购自山西晋城中晋药业有限公司，总黄酮含量≥95%，批号：20 190527；Ver 购自哈药集团三精制药股份有限公司，规格：2 mL，5 mg，批号：190412；硝基蓝四氮唑（nitro blue tetrazolium，NBT）购自上海前进试剂厂，批号：190105；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）试剂盒和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）酶联免疫（enzymelinked immunoassay，ELISA）试剂盒购自南京建成生物工程研究所，批号：20190413、20190127、20190506、20190411、20190317、20 190125；Akt、磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）抗体购自英国Abcam 公司，批号：ab179463、ab38449；Nrf 2、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）抗体购自北京博奥森生物科技有限公司，批号：20190131、20 190427；β-actin 抗体购自美国CST 公司，批号：3700S；山羊抗兔IgG 二抗购自美国Bioworld 公司，批号：BS13278。

1.3 动物分组、给药与模型制备 按照随机数表法，将192 只实验用SD 大鼠分为假手术组、模型组、HLF（25、50、100 mg/kg）组和Ver 1 mg/k 组[7-9]，各32 只；造模前10 min 腹腔注射给药，假手术组和模型组大鼠给予0.9%氯化钠溶液。除假手术组外的其他组大鼠均参照文献[10]报道的夹闭左冠状动脉前降支30 min 的方法复制心肌缺血再灌注大鼠模型，夹闭左冠状动脉前降支后心电图ST 段弓背抬高、T 波高耸，30 min 后恢复血流再灌注后ST 段抬高降低、T 波降低，即可判定为造模成功；假手术组行手术通路但不夹闭冠状动脉前降支。再灌注2 h 后检测各指标。

1.4 观察指标

1.4.1 心肌梗死体积检测 各组随机取8 只大鼠，麻醉后颈椎脱臼处死，开胸后取左冠状动脉前降支血流供应区的左心室组织，2 mm 厚度切片，置浓度2%的NBT溶液、恒温37 ℃避光孵育1 h（正常区呈紫黑色），通过图像分析系统计算心肌梗死体积。

1.4.2 心肌组织病理学检查及损伤评分 各组随机取8只大鼠，麻醉后颈椎脱臼处死，开胸后取左冠状动脉前降支血流供应区的左心室组织，置浓度4%多聚甲醛溶液常温固定72 h后，行石蜡浸泡包埋、5 μm 厚度切片、脱蜡水化、HE 染色（苏木素溶液染色10 min、伊红水溶液染色3 min）、梯度乙醇脱水和二甲苯透明后采用中性树胶封片，通过显微镜观察。损伤评分：根据心肌组织病变面积分别从出血、间质水肿、中性粒细胞浸润、变性坏死4个方面进行评分：未见病变计0分，病变视野比例≤1/4 计1 分、＞1/4 计2 分、≥1/2 计3 分，4 个方面之和即为损伤评分。

1.4.3 心肌细胞超微结构观察 各组随机取8只大鼠，麻醉后颈椎脱臼处死，开胸后取左冠状动脉前降支血流供应区的左心室组织，切割成5 mm3组织块置于4℃、4%戊二醛固定24 h，4 ℃、1%锇酸固定3 h，然后依次进行脱水、氧化丙烯置换、环氧树脂包埋处理后，70 nm 厚度超薄切片，经醋酸双氧铀、柠檬酸铅双重电子染色后通过透射电子显微镜观察细胞超微结构。

1.4.4 心肌组织生化指标检测 取各组剩余的8 只大鼠，麻醉后颈椎脱臼处死，开胸后取左冠状动脉前降支血流供应区的左心室组织，剪碎、研磨匀浆后加入4 ℃裂解液，冰上静置30 min 充分裂解，4 ℃、3 500 rpm 离心15 min 取上清液，采用硫代巴比妥酸法检测心肌MDA 含量，黄嘌呤氧化法、钼酸铵法检测SOD、CAT 活力，ELISA 法检测TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

1.4.5 心肌组织蛋白表达检测 取1.4.4 制备的心肌组织匀浆液，4 ℃、12 000 rpm 离心30 min 取上清液，BCA 法测定总蛋白量、沸水浴5 min 行蛋白高温变性，取30 μg总蛋白行SDS-PAGE胶电泳分离、转PVDF膜、5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h、滴加目标蛋白、β-actin一抗4 ℃孵育过夜，洗膜后滴加IgG 二抗室温孵育1 h，洗膜后滴加DAB 显色剂，以β-actin 为内参，通过条带灰度值半定量目的蛋白相对表达。

1.5 统计学方法 运用SPSS 17.0 对实验数据进行统计分析，数据以均数±标准差（）表示，多样本间比较行单因素方差分析，样本间两两比较行LSD-t检验，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HLF 对心肌缺血再灌注大鼠心肌梗死体积的影响 与假手术组比较，模型组心肌梗死体积百分比显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，HLF 50、100 mg/kg 组和Ver 1 mg/kg 组心肌梗死体积百分比显著降低（P＜0.01）；与Ver 1 mg/kg 组比较，HLF 100 mg/kg组心肌梗死体积百分比显著降低（P＜0.01）。见表1。

2.2 HLF 对心肌缺血再灌注大鼠心肌组织病理学改变及损伤评分的影响 假手术组大鼠左心室心肌纤维排列整齐有序、心肌细胞形态结构正常，未见异常；模型组呈现心肌纤维紊乱无序，可见部分心肌纤维断裂，心肌细胞数量减少，胞核固缩、深染、偏移，可见炎性细胞浸润；较模型组，HLF 各剂量和Ver 1 mg/kg组左心室心肌组织病理学改变呈不同程度减轻；其中HLF 100 mg/kg 组未见心肌纤维断裂和胞核偏移，炎性细胞浸润较少。损伤评分：较假手术组，模型组左心室心肌损伤评分显著升高（P＜0.01）；较模型组，HLF 50、100 mg/kg 组和Ver 1 mg/kg 组损伤评分显著降低（P＜0.01）；较Ver 1 mg/kg 组，HLF 100 mg/kg组损伤评分显著降低（P＜0.05）。见表1，图1。

图1 各组大鼠心肌组织病理学改变的影响（×200 倍，n =8）

表1 各组大鼠心肌梗死体积和损伤评分比较（，n =8）

表1 各组大鼠心肌梗死体积和损伤评分比较（，n =8）

注：与假手术组比较，## P ＜0.01；与模型组比较，△△P ＜0.01；与Ver 组比较，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01

2.3 HLF 对心肌缺血再灌注大鼠心肌细胞超微结构改变的影响 假手术组左心室心肌细胞膜、胞核、细胞器、染色质等超微结构均未见异常；模型组可见胞膜破裂，肌丝溶解断裂，线粒体数量减少、膜破裂、嵴断裂溶解，核仁边界不清，染色质固缩等超微结构病变；较模型组，HLF 各剂量和Ver 1 mg/kg 组心肌细胞超微结构病变呈不同程度减轻，其中HLF 100 mg/kg组线粒体数量较多、结构完整，核较为清晰，染色质分布均匀。见图2。

图2 各组大鼠心肌细胞超微结构改变的影响（×10 000 倍，n=8）

2.4 各组大鼠心肌组织MDA 含量和SOD、CAT 活力的影响 见表2。

表2 各组大鼠心肌组织MDA 含量和SOD、CAT 活力的影响（，n =8）

表2 各组大鼠心肌组织MDA 含量和SOD、CAT 活力的影响（，n =8）

注：与假手术组比较，## P ＜0.01；与模型组比较，△△ P ＜0.01；与Ver 组比较，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01

2.5 各组大鼠心肌组织TNF-α、IL-1β、IL-6 含量的影响 见表3。

表3 各组大鼠心肌组织TNF-α、IL-1β、IL-6 含量的影响（，n =8） pg/mg

表3 各组大鼠心肌组织TNF-α、IL-1β、IL-6 含量的影响（，n =8） pg/mg

注：与假手术组比较，## P ＜0.01；与模型组比较，△P ＜0.05，△△ P ＜0.01；与Ver 组比较，▲P ＜0.05

2.6 HLF 对心肌缺血再灌注大鼠心肌Akt、p-Akt、Nrf2、NF-κB 蛋白表达及Akt 磷酸化的影响 与假手术组比较，模型组左心室心肌p-Akt、Nrf2 表达明显下调而NF-κB 表达明显上调、Akt 磷酸化（p-Akt/Akt）显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，HLF 50、100 mg/kg 组和Ver 1 mg/kg 组p-Akt、Nrf2 表达明显上调且NF-κB 表达明显下调（P＜0.01），Akt 磷酸化显著升高（P＜0.01）；与Ver 1 mg/kg 组比较，HLF 100 mg/kg 组p-Akt、Nrf2 表达上调且NF-κB 表达下调（P＜0.05或P＜0.01），Akt磷酸化升高（P＜0.01）。见图3，图4。

图3 各组大鼠心肌Akt、p-Akt、Nrf2、NF-κB 蛋白表达的影响（n =8）

图4 各组大鼠心肌Akt、p-Akt、Nrf2、NF-κB 蛋白相对表达及Akt 磷酸化的影响

3 讨论

近年来，急性心肌梗死发生率呈逐年上升趋势，及时通过药物或手术治疗恢复血流能够挽救部分急性心肌梗死患者生命。心肌缺血再灌注损伤严重影响着急性心肌梗死患者预后。

HLF 为山楂叶的主要有效成分，具有良好的抗炎、抗氧化等药理学作用。山楂叶为常用中药品种，《本草纲目》有记载山楂叶性平、味酸，具有活血化瘀、理气通脉、化浊降脂之功效，多用于气滞血瘀、胸痹心痛等症的治疗。本实验结果显示，HLF 治疗能够有效降低心肌缺血再灌注大鼠左心室心肌梗死体积，改善心肌纤维断裂、紊乱及炎性细胞浸润、心肌细胞坏死等病理性改变，降低心肌损伤评分，改善心肌细胞膜破裂、线粒体数量减少、嵴断裂溶解、染色质固缩等超微结构病变，并且HLF 100 mg/kg 组效果优于Ver 1 mg/kg 组，提示HLF 对心肌缺血再灌注大鼠心肌病理学改变和细胞超微结构病变具有保护作用。

氧化应激和炎症反应在心肌缺血再灌注损伤疾病进展过程中发挥着重要作用。急性心肌梗死及血流再灌注过程，线粒体电子传递链遭破坏导致活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量生成、以ROS 为底物的SOD、CAT 等抗氧化酶被过度消耗，致使ROS不能被还原代谢而蓄积，攻击核酸、蛋白质等大分子，破坏生物膜不饱和脂肪酸，生成具有生物毒性的MDA[11]。心肌缺血发生后将病理性刺激炎症因子大量释放，其中TNF-α、IL-1β、IL-6 做为炎性趋化因子，能够激发炎症反应而损伤心肌组织，并且TNF-α、IL-1β 能够刺激机体免疫应激，进一步促进炎症因子产生和释放，引发炎症级联反应[12]；IL-6 能够激活炎症细胞而加重炎症反应，能够刺激血管内皮细胞释放ROS[13]。本实验结果显示，HLF 治疗能够有效降低心肌缺血再灌注大鼠左心室心肌MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6 含量，提高SOD、CAT 活力，并且HLF 100 mg/kg组效果优于Ver 1 mg/kg 组，提示HLF 对心肌缺血再灌注大鼠心肌氧化应激和炎症反应具有抑制作用。

Nrf2 是一种核转录因子，对细胞氧化应激反应具有重要的调控作用[14]，生理状态下的Nrf2 与抑制剂Keap1 结合以无活性状态存在。Akt 是一种原癌基因，被磷酸化（p-Akt）激活后，能够诱导Nrf2 与Keap1 复合体解离，促进Nrf2 核转位并上调表达[15]。Nrf2 能够与激活抗氧化反应元件结合而诱导抗氧化酶（包括SOD、CAT）转录表达[16]；HO-1 为Nrf2 下游基因，研究[17]发现Nrf2/HO-1 通路是保护心血管系统氧化应激损伤的重要途径，HO-1 能够被Nrf2 诱导核转位和上调表达，HO-1 能够催化降解血红素、CO 等，抑制氧化应激损伤。NF-κB 能够诱导TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症细胞因子大量释放。任国强等[18]通过药物抑制NF-κB 表达能够显著降低心肌缺血再灌注大鼠炎症反应。研究[19]发现HO-1 能够抑制NF-κB 启动子IKKβ磷酸化进而抑制NF-κB 活化。本实验结果显示，HLF治疗能够明显上调心肌缺血再灌注大鼠左心室心肌p-Akt、Nrf2 表达并提高Akt 磷酸化，下调NF-κB 表达，HLF 100 mg/kg 组对p-Akt、Nrf2、NF-κB 表达的调控作用优于Ver 1 mg/kg 组，提示HLF 对心肌缺血再灌注大鼠心肌氧化应激和炎症反应的抑制作用可能与激活Akt/Nrf2 通路有关。

综上所述，HLF 对心肌缺血再灌注大鼠心肌病理学改变和细胞超微结构病变具有保护作用，作用机制可能与激活Akt/Nrf2 通路，抑制氧化应激和炎症反应有关。