孟欣雨 崔颖 穆兰 刘瑶

SOX基因家族是具有高迁移率族( HMG)特征性结构域的一类基因，其与肿瘤发生发展的关系已成为当下的研究热点。近年来备受关注的SOX2基因，现已确定为鳞状细胞癌癌基因谱[1]。SOX7作为抑癌基因，参与Wnt通路的异常表达，抑制肿瘤的发生发展，如在胃癌、子宫内膜癌等多种肿瘤中有相关的报道[2,3]，但其在喉癌发生发展中的表达水平与其临床病理特征的关系尚未报道。因此，本研究通过免疫组化染色检测喉癌及其对应癌旁正常上皮组织中SOX2、SOX7、β-catenin、CyclinD1蛋白的表达，初步探讨SOX2、SOX7、β-catenin及CyclinD1蛋白与喉癌临床病理特征的关系，并通过组间关联性分析上述四种蛋白在喉癌中表达关联性，以期为喉癌的发生发展提供一个初步的理论依据。

1 资料与方法

1.1临床资料 选取锦州医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科2019年1月～2020年7月的65例手术切除且病理学诊断为喉鳞状细胞癌患者的石蜡切片，其中40例患者对应癌旁正常上皮组织(距癌肿切缘0.5 cm以上，经病理确认)。所有患者均为初次治疗且术前均未行放化疗治疗。其中，男60例，女5例，年龄47～81岁，平均年龄61.11岁，其中≥60岁39例，<60岁26例；分期：T1期10例，T2期23例，T3期23例，T4期9例；声门上型18例，声门型47例；分化程度：高分化30例，中分化30例，低分化5例；术后病理回报有淋巴结转移者23例，无淋巴结转移者42例。所有患者吸烟史、饮酒史均以全或无为标准。本研究经医院伦理委员会批准，患者均已签署知情同意书。

1.2实验试剂 兔抗人SOX7多克隆抗体；兔抗人SOX2多克隆抗体；兔抗人β-catenin单克隆抗体；兔抗人CyclinD1单克隆抗体(上海安研商贸有限公司，AY-015621R，1∶200)，山羊抗兔多克隆抗体(上海安研商贸有限公司，AY-015621R，1∶100)；DAB显色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。

1.3染色方法 本研究采用免疫组化法检测各个组织中SOX2和SOX7蛋白的表达情况。具体检测步骤：(1)将恒温箱预热到60 ℃，石蜡切片放入后再烘烤2 h；脱蜡：二甲苯I (5 min)、二甲苯II (5 min)、二甲苯III (5 min)；水化：无水乙醇 (10 min×2)、95%乙醇 (10 min×2)、蒸馏水 (5 min×2)；加3%H2O2溶液于室温孵育(10 min)；蒸馏水泡洗(2 min×3)；热抗原修复：选择微波炉加热法。先将0.01 M抗原修复液，微波700 W加热(5 min)至沸腾状态，把片子放修复液中，再次200 W加热(2 min)，加热完成后置于室温自然冷却。PBS洗涤(5 min×2)；室温条件下，加山羊血清封闭(60 min)；甩净擦干片子上液体，拿组化笔圈出标记位置；滴加一抗(1∶200)后放免疫组化湿盒中，4 ℃孵育过夜；隔天将片子复温到室温，PBS溶液浸泡(5 min×3)；加二抗(1∶100)，20～37 ℃孵育(45 min)；PBS溶液洗涤(5 min×3)；在20～37 ℃环境中加SABC-POD工作液后静置(30 min)；PBS溶液洗涤(5 min×4)；DAB室温下反应(20 min)，镜下观察标记位置着色而背景未着色时，适时自来水冲洗终止反应；复染：加苏木精(1 min)后自来水冲洗; 梯度酒精脱水；透明：分别浸泡在二甲苯I、二甲苯II;封片：片子上滴中性树脂，覆上盖玻片，晾干后于四周涂抹透明指甲油。免疫组化阴性对照：0.01 MPBS-0.01% Triton液替代一抗，其他条件不变。

1.4统计学方法 采用SPSS26.0统计软件进行分析，计数资料以例数或百分比表示,组间比较采用χ2检验；组间关联性采用关联性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1SOX2、SOX7、β-catenin、CyclinD1在喉癌组织和癌旁正常上皮组织中的表达 SOX2、β-catenin及CyclinD1蛋白的在喉癌组织的阳性表达率明显高于癌旁正常上皮组织，而SOX7蛋白的阳性表达率在喉癌组织中明显低于癌旁正常上皮组织(表1、图1)。

表1 喉癌和癌旁正常上皮组织中SOX2、SOX7、β-catenin、CyclinD1的阳性表达例数(例，%)

2.2SOX2、SOX7、β-catenin、CyclinD1在喉癌中的表达与临床病理学特征之间的关系 在65例喉鳞癌样本中，SOX7、SOX2、β-catenin、CyclinD1蛋白的表达与淋巴结转移及T分期具有相关性(P<0.05)，而与年龄、性别、吸烟、饮酒、分化程度及临床分型无相关性(表2)。

图1 SOX2、SOX7、β-catenin、CyclinD1在喉癌和癌旁正常组织中的表达(DAB法×200)

表2 喉癌中SOX2、SOX7、β-catenin和CyclinD1的表达与临床及病理学特征的关系(例)

2.3SOX2、SOX7、β-catenin、CyclinD1蛋白在喉癌组织中表达的组间关联性分析 在65例喉癌样本中，SOX2和β-catenin蛋白同时阳性表达44例，同时阴性表达14例；SOX2和CyclinD1蛋白同时阳性表达46例，同时阴性表达15例；β-catenin和CyclinD1蛋白同时阳性表达42例，同时阴性表达14例；SOX7和β-catenin蛋白同时阳性表达16例，同时阴性表达8例；SOX7和CyclinD1蛋白同时阳性表达13例，同时阴性表达4例(表3～6)。

表3 在喉癌组织中SOX2与β-catenin、CyclinD1的组间等级相关分析(例)

表4 喉癌组织中β-catenin与CyclinD1的组间等级相关分析

表5 在喉癌组织中SOX7与β-catenin、CyclinD1的组间等级相关分析(例)

表6 在喉癌组织中SOX2与SOX7蛋白的组间关联性分析(例)

3 讨论

研究证明，SOX2蛋白在多种肿瘤组织中均呈高表达，如乳腺癌[4]、肺癌[5]等。Attramadal等[6]发现88%的口腔鳞状细胞癌患者出现SOX2蛋白高表达。Bass等[7]采用定量RT-PCR检测和RNA干扰实验表明SOX2是肺和食管鳞状细胞癌中的一种谱系存活癌基因，也证明了SOX2基因扩增会增加食管和肺鳞状细胞癌发生的风险。Aksoy等[8]提出SOX7基因的肿瘤抑制作用，在许多人类癌症中发现SOX7基因的表达下调，而SOX7蛋白高表达可抑制癌细胞增殖[9]。目前，SOX2、SOX7蛋白在头颈部鳞状细胞癌中的表达及预后报道尚少，且二者参与肿瘤发生发展的机制复杂。Wnt信号通路对细胞增殖和分化有重要调节作用[10]，β-catenin作为Wnt通路中关键性因子，可激活或抑制下游与肿瘤发生和转移相关的靶基因如MMP-9及 CyclinD1等[11]，从而对肿瘤细胞的增殖起到了促进或抑制作用。CyclinD1作为Wnt通路下游靶向基因，被认为能促进细胞周期从G1期进入S期，启动DNA的合成，参与细胞的增生、分化和凋亡，其异常表达参与了人类多种肿瘤的发生发展。

本研究收集了手术切除且病理学诊断为喉鳞状细胞癌的65例石蜡切片，其中对应癌旁正常上皮组织有40例，通过免疫组化染色检测SOX2蛋白在喉癌组织中表达阳性率为75.38%，明显高于癌旁正常上皮组织(10.0%)，结合患者临床病理特征分析发现，SOX2蛋白表达水平与T分期、淋巴结转移有关，但与年龄、性别、吸烟、饮酒、分化程度以及临床分型无相关性。Matsuoka等[12]、Sholl等[13]的研究中利用免疫组化染色方法发现SOX2蛋白在胃癌、肺癌等多种实体细胞肿瘤中均为高表达，且通过Wnt通路介导β-catenin、CyclinD1蛋白表达，本文结果与此一致，进一步证实了SOX2蛋白在喉癌组织中通过Wnt经典信号通路影响了β-catenin、CyclinD1蛋白的表达，从而促进喉癌的发生、发展。而喉癌组织中SOX7蛋白的表达阳性率仅为41.54%，低于其在癌旁正常上皮表达的阳性率(72.50%)，结合患者临床病理特征分析发现，SOX7蛋白表达水平与T分期、淋巴结转移有关。Costa等[14]报道称SOX7作为抑癌基因，可通过与Wnt通路中的β-catenin 蛋白结合，抑制β-catenin表达，降低下游靶基因CyclinD1蛋白的表达，而抑制细胞异常增殖，在结直肠癌、前列腺癌等多种肿瘤中也有类似报道。Zhang等[15]发现SOX7蛋白可抑制人SW480细胞中的Wnt信号通路，在mRNA和蛋白水平上抑制下游靶基因CyclinD1和 Survivin的表达，进而证实了SOX7基因通过拮抗结直肠癌细胞中的Wnt信号而影响细胞正常的凋亡和增殖；Zhong等[16]通过实时定量逆转录-聚合酶链反应和免疫组化在前列腺癌组织中发现了SOX7基因在mRNA和蛋白水平上的差异，证实了SOX7与β-catenin蛋白呈负相关，与本研究结果一致。本研究发现，喉癌组织中的β-catenin和CyclinD1蛋白表达的阳性率明显高于癌旁正常组织，且β-catenin、CyclinD1蛋白表达水平与T分期、淋巴结转移有关，与年龄、性别、吸烟、饮酒、分化程度以及临床分型无相关性；组间关联性分析也提示β-catenin和cyclinD1与SOX2蛋白间呈正相关，而与SOX7蛋白呈负相关，且β-catenin与CyclinD1的表达呈正相关，SOX2与SOX7的表达呈负相关。

综上所述，本研究初步发现SOX2、β-catenin、CyclinD1蛋白在喉癌组织中呈高表达而其癌旁正常上皮组织中呈低表达，SOX7蛋白在喉癌组织中呈低表达而其癌旁正常上皮组织中呈高表达，分析SOX2、SOX7、β-catenin、CyclinD1蛋白与临床病理特征之间的关系可知, 上述四种蛋白与喉癌的T分期、淋巴结转移有关，在喉鳞状细胞癌的浸润、转移中发挥重要作用。深入研究SOX2、SOX7基因在喉鳞状细胞癌发生、发展中的参与机制，利用转基因技术来调控SOX2、SOX7基因的表达，从而抑制喉鳞状细胞癌的发生、发展，可为今后喉鳞状细胞癌患者的生物靶向治疗提供了一个初步的理论依据。