张卫中，马素娜，张小静

(1.博爱县磨头镇卫生院，河南 博爱 454450；2.河南中医药大学中医药科学院病毒性疾病基础理论研究实验室，河南 郑州 450000；3.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000)

银屑病是一种慢性、反复复发的常见皮肤炎症性疾病，是伴随角化细胞过度增殖等现象的鳞屑丘疹性皮肤病，诱发因素复杂多样[1]。银屑病全球范围内的发病率为0.1%～3%，不同国家的发病率差异较大。发达国家发病率相对较高，为2%～3%；我国的发病率低于发达国家，为0.4%～2%[2-3]。银屑病是长期性疾病，目前暂无根治的方法和药物。近年来，从血论治银屑病成为中医药治疗银屑病的新思路。人永生化角质形成细胞(HaCaT)的增殖、凋亡和炎症反应与银屑病的发生发展密不可分[4-5]。白细胞介素(IL)-22是一种细胞因子，主要是由T细胞转化后形成的Th17细胞产生，与角质形成细胞的生长和分化密切相关，在银屑病的发病中有重要作用，可引起银屑病患者皮肤红斑。莪术醇是莪术的主要有效成分，具有抗病毒、抗癌、抗菌的作用。莪术醇或中药复方中加入莪术可有效抑制银屑病皮肤损害，其或可作为治疗药物的重要组成成分[6]。本研究探讨了莪术醇对HaCaT活力、细胞周期、细胞凋亡及STAT3信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂与仪器

注射用甲氨蝶呤(MTX)，上海信谊药厂有限公司产品，产品批号121D045，5 mg/支。莪术醇，购自上海艾汇生物科技有限公司，产品批号CC110546；胎牛血清、DMEM培养基均购自美国Gibco公司，产品批号依次是1982146，2041879；四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)试剂盒，均购自碧云天生物技术研究所，批号依次是C0009M-3，C1067M-2；STAT3抗体和p-STAT3抗体，购自美国promage公司，产品批号依次是ab68153、ab267373。BD FACSAria Ⅲ型流式细胞仪，美国Thermo公司产品；IX70型荧光倒置显微镜，日本Olympus公司产品。

1.2 细胞培养与处理

HaCaT细胞购自中国科学院上海细胞库。将HaCaT细胞用含体积分数100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基培养，37 ℃，每2～3 天换新培养基1次，细胞融合至80%左右时进行消化传代，选取对数生长期细胞进行实验。

1.3 检测指标

1.3.1 细胞增殖情况

将HaCaT细胞加入质量分数分别为 1.25，2.5，5，10，20，40，80 mg/L的莪术醇中培养；另将HaCaT细胞加入质量分数分别为12.5，25，50，100，200 μg/L的IL-22中培养；此外，将HaCaT加入IL-22 100 μg/L和莪术醇 10 mg/L、IL-22 100 μg/L和莪术醇 20 mg/L、IL-22 100 μg/L和莪术醇 40 mg/L、IL-22 100 μg/L和MTX 5 μg/mL中培养。空白对照组不做任何处理。以MTT试剂盒检测，在各组细胞培养至24，48，72 h时分别加入5 g/L的MTT溶液50 μL，在37 ℃下，孵育4 h；吸弃培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜后振荡反应15 min，用酶标仪于490 nm波长处检测各孔吸光度(OD)值。细胞活性(%)=实验组OD值/空白对照组OD值×100%。每组重复3次，取平均值。

1.3.2 细胞凋亡情况

将空白对照组、IL-22 100 μg/L组、IL-22 100 μg/L和莪术醇 10 mg/L、IL-22 100 μg/L和莪术醇 20 mg/L、IL-22 100 μg/L和莪术醇 40 mg/L、IL-22 100 μg/L和MTX 5 mg/L组细胞培养48 h，用不含EDTA的胰酶消化，离心，收集细胞，PBS漂洗2次，加500 μL结合缓冲液重新悬浮细胞。取1.0×106个细胞，PBS清洗后，加入100 μL结合缓冲液，轻轻吹打混悬细胞；分别加入25 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，涡旋混合均匀，室温避光孵育10 min；最后加入400 μL结合缓冲液，混合均匀；采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，Q3象限记作细胞早期凋亡率、Q2记作细胞晚期凋亡率。每组3个平行，重复3次。

1.3.3 HaCaT细胞上清培养液中IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和血管内皮生长因子(VEGF)的含量

将空白对照组、IL-22 100 μg/L组、IL-22 100 μg/L和莪术醇 10 mg/L、IL-22 100 μg/L和莪术醇 20 mg/L、IL-22 100 μg/L和莪术醇 40 mg/L、IL-22 100 μg/L和MTX 5 mg/L组细胞培养24 h，收集各组细胞上清培养液，严格按照ELISA检测试剂盒说明书检测IL-6、TNF-α和VEGF的含量。实验终止反应后，根据测定A450 mm吸光度。每组3个平行，重复3次。

1.3.4 STAT3和p-STAT3蛋白表达

采用蛋白质印迹法检测。蛋白样品SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜上，封闭液封闭2 h，一抗STAT3抗体和p-STAT3抗体(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后辣根过氧化物酶标记二抗(1∶1 000)室温孵育1 h，TBST洗膜后加入显影混合液显影。以β-actin为内参，应用凝胶成像系统分析蛋白条带的灰度值。每组3个平行，重复3次。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 不同质量分数的莪术醇对HaCaT细胞增殖率的影响

MTT检测显示：与空白对照组对比，24 h时，仅有莪术醇2.5 mg/L组HaCaT细胞增殖率增加，差异有统计学意义(P<0.05)；其他剂量组的增殖率无统计学意义(P>0.05)。48 h时，莪术醇2.5 mg/L组HaCaT细胞增殖增加，差别有统计学意义(P<0.05)。72 h时，莪术醇20，40，80 mg/L组的增殖率降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组24，48，72 h HaCaT细胞增殖率对比

2.2 不同质量分数的IL-22对HaCaT细胞增殖率的影响

与空白对照组对比，IL-22 50，100，200 μg/L组24 h和IL-22 100，200 μg/L组48 h时，HaCaT细胞增殖率增加，差别有统计学意义(P<0.05)；IL-22 25，50，100，200 μg/L组72 h时，HaCaT细胞增殖率增加，差别有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组24，48，72 h HaCaT细胞增殖率对比

2.3 不同质量分数的莪术醇对IL-22诱导的HaCaT细胞增殖率的影响

与空白对照组对比，24，48，72 h时，IL-22 100 μg/L组HaCaT细胞增殖率增加，差别有统计学意义(P<0.05)。与IL-22 100 μg/L组对比，加20，40 mg/L莪术醇和MTX 5 mg/L组在48，72 h时的HaCaT细胞增殖率均降低，差别均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组24，48，72 h HaCaT细胞增殖率对比

2.4 不同质量分数的莪术醇对HaCaT细胞凋亡的影响

与空白对照组对比，IL-22 100 μg/L组HaCaT细胞早期、晚期凋亡率降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与IL-22 100 μg/L组对比，加20，40 mg/L莪术醇和MTX 5 mg/L组的HaCaT细胞早期、晚期凋亡率增高，差别有统计学意义(P<0.05)，并有一定剂量依赖性。见表4。

表4 各组HaCaT细胞早期、晚期凋亡率对比

2.5 不同质量分数的莪术醇对IL-22诱导的HaCaT细胞上清培养液中TNF-α、VEGF和IL-6含量的影响

与空白对照组对比，IL-22 100 μg/L组HaCaT细胞上清培养液中TNF-α、VEGF和IL-6的含量降低，差别有统计学意义(P<0.05)。与IL-22 100 μg/L组对比，加20，40 mg/L莪术醇和MTX 5 mg/L组的HaCaT细胞上清培养液中的TNF-α、VEGF和IL-6含量增加，差别有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 各组TNF-α、VEGF和IL-6含量对比

2.6 不同质量分数的莪术醇对IL-22诱导的HaCaT STAT3和p-STAT3蛋白的影响

与空白对照组对比，IL-22 100 μg/L组HaCaT细胞中p-STAT3蛋白表达降低，差别有统计学意义(P<0.05)。与IL-22 100 μg/L组对比，加入10，20，40 mg/L莪术醇和MTX 5 mg/L组的HaCaT细胞的p-STAT3蛋白表达水平增高，差别有统计学意义(P<0.05)；而STAT3蛋白表达较之差别无统计学意义(P>0.05)。表6。

表6 各组 STAT3和p-STAT3蛋白表达水平对

3 讨 论

银屑病的组织病理改变包括角质形成细胞分化程度较低、过度增殖及炎症反应等，临床表现为鳞屑脱落、红斑、瘙痒及继发感染，常见发病区域为头皮和四肢[6-7]。表皮的角质形成细胞经历1个细胞周期(分裂、分化成熟、脱落)需要28 d左右，但银屑病患者表皮细胞完成一个周期只需约5.5 d，由此说明角质形成细胞增殖分化成熟周期与银屑病的进展相关[8]。因此，本实验通过检测角质形成细胞的增殖活性、细胞凋亡率来模拟和研究银屑病细胞损伤。

莪术具有广泛的临床应用，主要作用是行气解郁、破瘀、止痛。研究结果显示，莪术参与细胞的增殖、迁移、分化、凋亡、自噬、炎症等过程，可作为治疗银屑病的外用药[9]。莪术醇是莪术的有效成分之一，其是否参与抑制银屑病进展目前尚不完全清楚。研究表明，莪术醇具有抗菌、抗炎和抗肿瘤的作用，具有良好的应用前景和开发空间[10-11]。本实验以角质形成细胞为研究对象，研究莪术醇对角质形成细胞活性、凋亡的影响，以及可能的调控机制。结果发现，莪术醇能够抑制角质形成细胞活性；20,100 mg/L 莪术醇处理的细胞早期、晚期凋亡率比正常培养细胞增加。

角质形成细胞增殖、分化、凋亡受到多种信号分子和信号通路间接或直接的调控，如STAT3信号通路[12]。STAT3信号转导途径影响多种信号分子向细胞核的信号传递，并且广泛参与各种细胞存活、细胞周期和凋亡等生物学特性[13-14]。STAT3参与细胞的分化和胚胎细胞发育等过程，并具有重要的调控作用，在肿瘤细胞中参与细胞过度增殖、血管生成、细胞转移和免疫逃避等生物学特性的调控[15-16]。研究表明，在银屑病患者体内通过激活STAT3信号通路可引起细胞过度增殖，从而导致银屑病表皮细胞生长周期时间缩短[17]。STAT3信号通路在银屑病患者体内可能通过增加磷酸化STAT3的表达量，从而导致细胞免疫功能异常[18]。因此，本实验为了探究莪术醇的可能作用机制，采用莪术醇处理角质形成细胞，结果发现其能显著降低p-STAT3蛋白的表达，表明莪术醇可能通过调控STAT3通路参与角质形成细胞增殖和细胞凋亡。此可能是治疗银屑病的重要调控机制。综上所述，莪术醇降低角质形成细胞过度增殖的能力和诱导细胞凋亡，可能与角质形成中STAT3信号通路有密切关系。