李宁,沈璐,牛丽君,李卓,邱志霞,张德文

(1.中国药科大学药学院,江苏 南京 211198;2.长白山科学研究院,吉林 长白山保护开发区管理委员会 133613)

五味子是长白山珍贵的药用植物,具有保肝、镇静、催眠、抗衰老、抗肿瘤、抗疲劳、免疫调节等功效[1],对急慢性、病毒性肝炎等多种肝脏疾病有良好的治疗效果,这主要与木脂素类成分相关,其中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酯甲是最为重要的几种生物活性木脂素[2]。五味子醇甲是中药五味子中含量最高的木脂素成分,2020年版《中国药典》将五味子醇甲的含量作为五味子的质量标准[3]。五味子醇甲具有明显的镇静催眠、抗癌、抗炎、保护肝细胞和抗自由基活性等作用。虽然五味子提取物及其多种制剂有良好的疗效,但五味子主要成分的体内生物利用度较低,其中五味子醇甲的生物利用度仅为15%左右。五味子醇甲在体内吸收迅速,易从血液分布到各个组织脏器,比如肝、肾、心、脾、脑等,在肝脏中分布浓度最高[4]。已有报道发现,CYP3A是五味子醇甲的主要代谢酶,羟基化和去甲基化可能是五味子醇甲的主要代谢方式[5]。五味子醇甲大多以代谢产物的形式:或进入胆汁,进入肠道后随粪便排出体外;或进入血液,经肾脏随尿液排出体外[6]。

综合考虑五味子醇甲吸收迅速、消除快的体内药动学特性,本研究重点考察五味子醇甲的体内处置过程,从药动学角度,探讨五味子醇甲低生物利用度的原因。借助肝脏、肠道首过代谢动物模型,研究肠道、肝脏代谢在五味子醇甲体内转化过程中的作用以及对生物利用度的影响,以期为临床研究提供更多理论依据。

1 材料和方法

1.1 药品与试剂

五味子醇甲(纯度:99.6%)购自中国食品药品检定研究院；GL-V9(纯度>99.3%,内标)由中国药科大学药化教研室提供;乙腈、甲醇(色谱纯)购自美国Tedia公司;聚乙二醇400(PEG400)、羟丙基-β-环糊精为分析纯;其他试剂均为市售分析纯。精密称量五味子醇甲和GL-V9各1 mg,溶于1 mL DMSO,配制成1.0 mg·mL-1的储备液,放置于4 ℃冰箱中备用。

1.2 仪器

质谱仪(型号:AB Sciex 4000,Applied Biosystems公司);超高效液相色谱仪(型号:LC-30A,日本SHIMADZU公司);电子天平(型号:AB135-S,METTLER TOLEDO公司);旋涡混合器(型号:XW-80C,上海医大仪器厂);低温超速离心机(型号:5430-R,Eppendorf公司);数控超声清洗器(型号:KQ2200DE,昆山市超声仪器有限公司)。

1.3 给药剂量及药物配制

精密称量一定量的五味子醇甲,按照10%DMSO+30%PEG400+60%生理盐水(含10%羟丙基-β-环糊精)的比例配制成一定体积的药液,按照10 mg·kg-1的剂量,静脉注射(i.v)或幽门静脉注射(i.p.v)给药。

精密称量一定量的五味子醇甲,按照10%DMSO+30%PEG400+60%生理盐水(含10%羟丙基-β-环糊精)的比例配制成一定体积的药液,分别按照10、20、50 mg·kg-1剂量，灌胃(i.g)给药;或分别按20 mg·kg-1剂量，十二指肠穿刺(i.d)给药。

1.4 实验动物

SD大鼠,雄性，体质量180～220 g,由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供,生产许可证号:SCXK(沪)2018-0006,在中国药科大学实验动物中心饲养1周后使用。给药前12 h和给药后4 h禁食,试验期间自由饮水。实验过程按照中国药科大学实验动物伦理相关规定进行(批准号:20190066)。

1.5 动物试验与取样方法

1.5.1 整体药动学研究 SD大鼠随机分为i.v给药组和3个不同剂量i.g给药组，每组4只。清醒大鼠尾静脉注射五味子醇甲10 mg·kg-1,在给药前和给药后2、5、10、20、30、45 min,1、2、4 h经颈静脉处取全血至肝素化试管中,8 000 r·min-1离心5 min,分离血浆并于-70 ℃保存待测;清醒大鼠分别i.g给予五味子醇甲10、20、50 mg·kg-1，在给药前和给药后5、10、20、30、45 min,1、2、4 h经颈静脉取全血至肝素化试管中,8 000 r·min-1离心5 min,分离血浆并于-70 ℃保存待测。

1.5.2 五味子醇甲的总体代谢研究 SD大鼠分为i.d给药组和i.g给药组，每组4只。采用20%乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠(0.1 mg·kg-1),以仰卧位固定于手术板上。整个手术期间手术板置于白炽灯下保温,并用润湿棉花覆盖创口。在大鼠颈部一侧剪开颈静脉处皮肤,用镊子撕开肌肉分离出一侧颈静脉,将远心端结扎防止泵血。用剪刀将颈静脉剪一小口后用连接有注射器的肝素化的胆管插管插入颈静脉中,使插管前段进入颈静脉约4～7 mm,用注射器轻轻抽吸插管,回血后用手术线结扎固定,再推注含0.05%肝素钠的生理盐水0.1 mL防止凝血;沿腹白线剪开大鼠腹腔小心找到十二指肠,避开肠系膜静脉密集处,用注射器穿刺给予药物20 mg·kg-1,经颈静脉采血。同时为了研究胃部对五味子醇甲代谢的影响,按照同样的手术方法,i.g给予大鼠五味子醇甲20 mg·kg-1,经颈静脉采血。

分别于给药前和给药后2、5、10、20、30 min,1、2、4 h从颈静脉插管处用注射器取血200 μL(弃去前端含肝素钠部分)并立即转移至肝素化试管中,再补以200 μL含0.05%肝素钠的生理盐水,血样8 000 r·min-1离心5 min,分离血浆并于-70 ℃保存待测。

1.5.3 五味子醇甲肠代谢研究 在大鼠(n=4)麻醉状态下,沿腹白线剪开大鼠腹腔,找到十二指肠,露出肝门静脉并找到侧支幽门静脉,游离出约0.5 cm幽门静脉段,两端穿线,将远离肝门静脉端结扎,然后由帮手将靠近肝门静脉的一侧埋线轻轻提起,防止泵血,用针头在幽门静脉上穿刺幽门静脉,将连接有注射器的肝素化的胆管插管插入幽门静脉中,使插管前段进入肝门静脉约2 mm,用注射器轻轻抽吸插管,回血后用手术线结扎固定,再推注含0.05%肝素钠的生理盐水0.1 mL防止凝血。

经i.d给予20 mg·kg-1的五味子醇甲,分别于给药前和给药后2、5、10、20、30 min,1、2、4 h从幽门静脉插管处用注射器取血200 μL(弃去前端含肝素钠部分)并立即转移至肝素化试管中,再补以200 μL含0.05%肝素钠的生理盐水,血样8 000 r·min-1离心5 min,分离血浆并于-70 ℃保存待测。

1.5.4 五味子醇甲肝首过代谢研究 SD大鼠分为颈静脉采血组和幽门静脉采血组，每组4只。在大鼠麻醉状态下,按上述方法,分别进行颈静脉插管和幽门静脉插管。i.p.v给予10 mg·kg-1的五味子醇甲,分别于给药前和给药后2、5、10、20、30 min,1、2、4 h从颈静脉插管处用注射器取血200 μL(弃去前端含肝素钠部分)并立即转移至肝素化试管中,再补以200 μL含0.05%肝素钠的生理盐水,血样8 000 r·min-1离心5 min,分离血浆并于-70 ℃保存待测。

1.6 药代动力学参数的计算方法

主要的药动学参数利用WinNonlin 8.0软件以统计矩方法计算:达峰浓度(Cmax):采用实测值;达峰时间(Tmax):采用实测值;血药浓度-时间曲线下面积(AUC0-t)值:采用梯形法计算;消除半衰期(t1/2)=0.693/ke,其中ke为末端相消除速率常数;平均滞留时间(MRT)=AUMC/AUC，其中AUMC为时间与血药浓度的乘积-时间曲线下面积。

绝对生物利用度(Ft)计算:

其中Fa×Fg为肠道利用度,Fh为肝脏利用度;AUCi.g和AUCi.v分别为i.g和i.v给药后的系统暴露量;Dosei.v和Dosei.g分别为i.v和i.g给药的剂量。

Fh计算:

其中AUCi.p.v和AUCi.v分别为i.p.v和i.v给药后的系统暴露量；Dosei.v和Dosei.p.v分别为i.v和i.p.v给药的剂量。

Fa×Fg计算:

其中AUCi.d,portal和AUCi.d,system分别为i.d给药后的幽门静脉采血和颈静脉采血的暴露量;Dose为i.d给药的剂量;Rb为全血与血浆比值,本研究中设定为1;Qportal为肝门静脉血流量,设定为39.2 mL·min-1·kg-1。

胃部利用度(FG)计算:

其中AUCi.g和AUCi.d分别为i.g和i.d给药后的系统暴露量;Dosei.g和Dosei.d分别为i.g和i.d给药的剂量。

1.7 五味子醇甲的体外代谢研究

将一定浓度的五味子醇甲10 μL(终浓度为1 μmol·L-1)加至含有肝、肠微粒体的反应体系中预温孵5 min(5 mmol·L-1MgCl2+0.5 mg·mL-1微粒体,反应终体积为200 μL),加入NADPH 1.0 mmol·L-1启动反应,分别在0、10、20、30 min,1、2 h取点并立即转移至冰浴中。取100 μL温孵样品加入400 μL冰乙酸乙酯终止反应,涡旋振荡3 min,12 000 r·min-1离心5 min,取上清300 μL于离心管中,并在离心浓缩仪中挥干,测定前用100 μL流动相复溶(含内标),10 μL进样LC-MS/MS系统分析。温孵样品每个时间点重复3份。

利用WinNonlin 8.0软件计算药动学参数,以末端指数消除拟合五味子醇甲的体外消除半衰期，并按照如下公式拟合体外的内在清除率(CLint)。

1.8 样品处理

采用乙腈逐级稀释五味子醇甲储备液,配制一系列不同浓度的标准工作液(1、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000 ng·mL-1)放置于4 ℃冰箱中备用;精密吸取50 μL不同浓度的标准工作液和质控样品工作液(3个水平的质控样品2、50、800 ng·mL-1,用于样品分析过程中的质量控制和检测精度控制),于离心浓缩仪挥干后分别加入50 μL的大鼠空白血浆,加入100 μL 50 ng·mL-1的GL-V9溶液,另加入50 μL空白乙腈,振荡5 min后于12 000 r·min-1,4 ℃离心10 min,取一定体积的上清液于进样小瓶,进样体积为5 μL。

1.9 样品检测方法

采用LC-MS/MS方法测定血浆样品和体外温孵样品:色谱柱为Agilent Extend C18柱(1.8 μm,4.6 mm×50 mm);柱温40 ℃;流动相A为0.1%甲酸水溶液,流动相B为乙腈,流速为0.8 mL·min-1,采用梯度洗脱:0.01～0.5 min,5%B;0.5～1.0 min,5%B;1.0～2.0 min,90%B;2.0～2.5 min,90%B;2.5～3.0 min,5%B;3.0～3.5 min,5%B。质谱离子源为Turbo Spray源,正离子；喷雾电压5 500 V；Gas1,45；Gas2,45；离子源温度为500 ℃；去簇电压DP为80 V；扫描方式为多级反应监测(MRM)。用于定量分析的离子反应分别为m/z433.1→384.2(CE 25 V,五味子醇甲),410.2→126.1(CE 28 V,内标)。

该LC-MS/MS方法进行了简单的方法学考察,主要包括专属性、精密度、准确度和长期冷冻稳定性、处理前稳定性等,结果见表1～2。发现在五味子醇甲和内标GL-V9出峰位置未有明显干扰;精密度和准确度的RSD在15%以内;无明显的基质干扰效应;血浆样品-70 ℃长期冷冻稳定性、冻融稳定性、处理前放置稳定性、处理后放置稳定性并无明显降低,说明该方法可以应用于血浆样品中五味子醇甲的测定。

表1 大鼠血浆中4个浓度水平五味子醇甲批内和批间精密度、准确度结果Table 1 Intra-batch and inter-batch precision and accuracy of schizandrin in rat plasma at LLOQ and three QC levels

表2 大鼠血浆中五味子醇甲的基质效应、回收率以及不同条件下的稳定性研究Table 2 Matrix effect,recovery assay of schizandrin at three QC levels and stability investigation under different conditions at low and high QC levels in rat plasma

2 结果

2.1 五味子醇甲的整体药动学过程

大鼠i.v给予10 mg·kg-1的五味子醇甲后,血浆中五味子醇甲的血药浓度-时间曲线如图1所示。药动学参数如表3所示，i.v给药后，五味子醇甲在大鼠体内半衰期短(t1/2,0.72 h)、平均停留时间短(MRTlast,0.71 h)、清除率高(CL,3.87 L·h-1·kg-1)、表观分布容积较大(Vz,4.04 L·kg-1)。

图1 大鼠i.v给予10 mg·kg-1五味子醇甲后血浆中五味子醇甲浓度-时间曲线Fig.1 The plasma concentration-time profile of schizandrin in rats after i.v administration of 10 mg·kg-1

大鼠分别i.g给予10、20、50 mg·kg-1五味子醇甲后,血浆中五味子醇甲的血药浓度-时间曲线如图2所示。药动学参数如表3所示，i.g给药后,五味子醇甲吸收快(Tmax，0.37、0.44、0.33 h)、平均停留时间短(MRTlast，1.74、1.65、1.27 h),AUC0-4 h为303.66、559.24、1 185.20 h·ng·mL-1,F为12.0%、11.0%、9.35%,高剂量时F略有降低,这些主要的药动学参数与文献报道接近[1,7]。

图2 大鼠i.g给予10、20、50 mg·kg-1五味子醇甲后血浆中五味子醇甲浓度-时间曲线Fig.2 The plasma concentration-time profile of schizandrin in rats after i.g administration of 10,

表3 大鼠i.v给予10 mg·kg-1,i.g给予10、20、50 mg·kg-1五味子醇甲的主要药动学参数Table 3 The pharmacokinetic parameters of schizandrin in rats after i.v administration of 10 mg·kg-1 and i.g administration of 10,20,50 mg·kg-1

2.2 大鼠i.g和i.d给予五味子醇甲后经颈静脉采血的体内药动学过程

大鼠分别i.g和i.d给予20 mg·kg-1的五味子醇甲后,颈静脉血浆中五味子醇甲的血药浓度-时间曲线图3所示。

图3 大鼠i.g和i.d给予20 mg·kg-1五味子醇甲后颈静脉中五味子醇甲浓度-时间曲线Fig.3 The plasma concentration-time profile of schizandrin in rats after i.g and i.d administration of 20 mg·kg-1

经i.g和i.d给药的AUC0-4 h相近,分别为467.98、469.03 h·ng·mL-1,这说明胃部首过效应对五味子醇甲的影响几乎可以忽略(FG接近100%),药动学参数如表4所示。

表4 大鼠i.g和i.d给予20 mg·kg-1五味子醇甲后颈静脉和幽门静脉血中五味子醇甲的主要药动学参数Table 4 The pharmacokinetic parameters of schizandrin in jugular vein and pyloric vein after i.g and i.d administration

2.3 大鼠i.v和i.p.v给予五味子醇甲后经颈静脉采血的药动学过程

大鼠分别经i.v和i.p.v给予10 mg·kg-1的五味子醇甲,经颈静脉采血后,颈静脉血浆中五味子醇甲的浓度-时间曲线分别如图4所示。

图4 大鼠i.v和i.p.v给予10 mg·kg-1五味子醇甲后颈静脉中五味子醇甲浓度-时间曲线Fig.4 The plasma concentration-time profile of schizandrin in rats after i.v and i.p.v administration of 10 mg·kg-1

与i.v给药(AUC0-4 h=2 547.79 h·ng·mL-1)相比,i.p.v给药后AUC0-4 h减小,为1 960.22 h·ng·mL-1;经公式计算,可以估算大约有76.94%(Fh)进入系统,肝摄取率为23.06%(1-76.94%),也就是通过i.p.v给药的五味子醇甲大约有23.06%摄取进入肝脏后消除。药动学参数见表5。

表5 大鼠i.v和i.p.v给予10 mg·kg-1五味子醇甲的主要药动学参数Table 5 The pharmacokinetic parameters of schizandrin in rats after i.v and i.p.v administration of 10 mg·kg-1

2.4 大鼠i.d给予五味子醇甲经幽门静脉采血的体内药动学过程

大鼠i.d给予20 mg·kg-1五味子醇甲后，幽门静脉血浆中五味子醇甲的浓度-时间曲线如图5所示。经i.d给药后,幽门静脉中五味子醇甲的暴露量显著高于颈静脉,分别为1 648.08、469.03 h·ng·mL-1,经公式计算(以肝门静脉血流量39.2 mL·min-1·kg-1计算)的肠道利用度为21.53%(Fa×Fg),因此肠道发生代谢的部分为78.47%(1-21.53%)。药动学参数见表4。

图5 大鼠i.d给予20 mg·kg-1五味子醇甲后幽门静脉中五味子醇甲的浓度-时间曲线Fig.5 The plasma concentration-time profile of schizandrin in rats in pyloric vein after i.d administration of 20 mg·kg-1

2.5 五味子醇甲的体外代谢研究

五味子醇甲在肝、肠微粒体(终浓度为0.5 mg·mL-1)体系中,可发生明显的NADPH依赖的代谢,2 h内基本代谢完全,如图6所示;在肝脏微粒体中,五味子醇甲的代谢半衰期约为15.4 min;肠道微粒体中的代谢半衰期约为49.2 min,主要参数如表6所示。与文献报道一致[5,8],五味子醇甲在肠道和肝脏微粒体体系中可以发生明显的NADPH依赖的代谢,其代谢速率快,内在清除率CLint分别为0.090 5、0.028 5 mL·min-1·mg-1(表6),这一情况也与体内情况一致,进一步说明五味子醇甲在吸收过程中的代谢在很大程度上会影响其体内的系统暴露量。

图6 五味子醇甲在肝、肠微粒体体系中的稳定性(n=3)Fig.6 The in vitro metabolic stability of schizandrin in the hepatic and intestinal microsomes system(n=3)

表6 五味子醇甲在肝、肠微粒体体系中药动学参数(n=3)Table 6 The in vitro metabolic parameters of schizandrin in the hepatic and intestinal microsomes system (n=3)

3 讨论

肝脏、肠道代谢在药物体内转化、首过效应、肝肠循环等过程中发挥着非常重要的作用,很大程度上影响药物的生物利用度。可以通过建立肝肠首过代谢动物模型,分别经i.v、i.g、i.p.v、i.d这4种给药方式,比较不同给药途径的AUC,评价肝脏、肠道首过效应对生物利用度的贡献程度[9-10]。

考虑五味子醇甲吸收迅速、消除快的体内药动学特性,本研究设计了一系列实验,考察i.g给予不同剂量的五味子醇甲后,大鼠血浆中五味子醇甲的经时变化过程,并计算其生物利用度;其后建立大鼠肝前首过代谢模型:比较i.v给药和i.p.v给药后,颈静脉血中五味子醇甲AUC的差异,说明肝首过代谢对五味子醇甲的影响;比较i.g给药和i.d给药后,颈静脉血中五味子醇甲AUC的差异,说明胃部代谢对五味子醇甲的影响;比较i.d给药后,幽门静脉内五味子醇甲AUC与颈静脉内五味子醇甲AUC的差异,间接说明肠道对五味子醇甲利用度的影响。

以五味子醇甲在肠道(Fa×Fg,21.53%)和肝脏(Fh,76.94%)的利用度,估算五味子醇甲的总体利用度Ft为16.57%(Fa×Fg×Fh,21.53%×76.94%),这与经i.g给药颈静脉采血后计算的生物利用度接近(18.33%)。同时发现i.g或i.d给药,五味子醇甲的达峰时间均在1 h以内,这说明五味子醇甲吸收迅速；而在4 h结束采样前,并未发现明显的肝肠循环,这可能与其主要的吸收方式为被动扩散有关,也可能与麻醉状态下胃肠蠕动程度降低相关。五味子醇甲在体外肝、肠微粒体体系中主要发生NADPH依赖的代谢清除,这可能是由于CYP3A是五味子醇甲的主要代谢酶系[5],其在肝脏、肠道中大量表达。体内外研究结果说明肝肠首过代谢在很大程度上影响五味子醇甲的生物利用度,而肠道代谢在五味子醇甲的首过代谢中贡献程度更大。因此,明确五味子醇甲首过效应发生的主要部位以及对其生物利用度的影响,有助于为五味子醇甲临床用药及开发新剂型提供理论依据。