林伟雄,邓李红,李美洲,陈仕妍,钟文峰,黄贵发,程学仁

(1.广东一方制药有限公司,广东 佛山 528244;2.广东省中药配方颗粒企业重点实验室,广东 佛山 528244;3.中国中药控股有限公司,广东 佛山 528303)

女贞子为木犀科植物女贞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果实,具有滋补肝肾,明目乌发的功效,用于眩晕耳鸣,腰膝酸软,须发早白等肝肾阴虚证[1]。2020年版《中国药典》收录了女贞子和酒女贞子2种饮片,女贞子经酒蒸或酒炖为酒女贞子后,“形如女贞子,表面黑褐色或灰黑色,常附有白色粉霜,微有酒香气”[1]。中医理论认为,女贞子生品性凉,以清肝明目、滋阴润燥为主,多用于肝热目眩、阴虚肠燥便秘等症;而酒能活血通络、祛风散寒,故炮制后的酒女贞子寒凉之性减弱,滋补肝肾作用增强,临床更多用于肝肾阴虚等证,现代临床亦可用于治疗慢性肝炎、高血脂等症[2-4]。

现代研究表明,女贞子主要包含环烯醚萜苷类、苯乙醇苷类、黄酮类、萜类、挥发油、脂肪酸等化学成分[5-6],其中最具活性和药用价值的属环烯醚萜苷类化合物,含量较高的有特女贞苷、女贞苷、女贞苷G13和橄榄苦苷等裂环环烯醚萜苷类,这类化合物具有抗氧化、增强免疫、抑制肿瘤、抗血脂等作用[7-8];另外苯乙醇类中的红景天苷和酪醇等具有抗菌、抗炎、抗肝损伤等多种生物活性[9-10]。女贞子经过酒蒸或酒炖等不同炮制方法以及在不同的炮制程度下,其活性成分会发生不同程度的分解与转化,与炮制品酒女贞子药性与药效的改变密切相关,进而影响其临床疗效。纪鑫等[11]测定了女贞子中非三萜类成分,与同批次女贞子相比,酒女贞子中5-羟甲基糠醛和红景天苷的含量大幅升高,而女贞子酒蒸后环烯醚萜苷类成分的含量普遍降低,因其分子结构中的环烯醚萜部分大多通过其裂环上的酯键与红景天苷或酪醇或羟基酪醇等苯乙醇类化合物相连,在高温高湿环境下易发生裂解[12-14]。在2020年版《中国药典》中仅规定了女贞子含量项下特女贞苷不得少于0.7%,酒女贞子中红景天苷含量不得少于0.2%的单指标含量限度要求,缺少女贞子药材及其炮制品酒女贞子的整体质量控制方法,因此有必要对酒蒸或酒炖不同炮制方法及不同炮制程度下的酒女贞子进行化学成分种类及含量变化的研究[1]。本研究建立女贞子炮制前后UPLC特征图谱,同时测定红景天苷、特女贞苷及女贞苷G13的含量,并运用聚类分析、主成分分析(PCA)与正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)等多模式识别方法对UPLC特征图谱中多指标变量进行统计分析,可有效监控女贞子不同炮制方法及不同炮制程度下的主要共性和差异性化学成分,为其药效物质基础及质量控制研究奠定基础。

1 材料

1.1 仪器

Waters H-Class型超高效液相色谱仪(美国Waters公司);ME204E型万分之一天平、XP26百万分之一天平(瑞士METTLER TOLEDO公司);KQ-500DE型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司);111B型二两装高速中药粉碎机(浙江瑞安市永历制药机械有限公司);MiliQ Direct 8型超纯水机(德国Merck公司)。

1.2 药品与试剂

5-羟甲基糠醛对照品(纯度≥98%,批号：wkq20041311)购自四川省维克奇生物科技有限公司);红景天苷(纯度99.4%,批号：110818-201507)、松果菊苷(纯度91.8%,批号：111670-201907)、特女贞苷(纯度95.0%,批号：111926-201906)对照品均购自中国食品药品检定研究院;女贞苷G13对照品(纯度95.0%,批号：8857)购自上海诗丹德标准技术服务有限公司。乙腈为色谱级,其余试剂为分析纯,水为超纯水。

11批女贞子药材(编号S1～S11)经广东一方制药有限公司魏梅主任药师鉴定为木犀科植物女贞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果实,来源信息详见表1。

表1 11批女贞子来源信息Table 1 Source information of 11 batches of Ligustri Lucidi Fructus

2 方法与结果

2.1 酒女贞子饮片炮制

取女贞子药材,除去杂质,均分3份,1份压破,得女贞子压破饮片,另2份为女贞子不压破饮片;取女贞子饮片置于容器中,用相当于黄酒质量1倍的饮用水稀释黄酒,每100 kg女贞子饮片用黄酒20 kg,闷润2～4 h后,取出,女贞子压破饮片酒蒸8.0 h,另2份女贞子不压破饮片分别酒蒸和酒炖8.0 h,每隔0.5 h取样，于烘箱中烘干,即得不同炮制方式和不同炮制时间下的酒女贞子饮片。

2.2 特征图谱的建立

2.2.1 色谱条件 色谱柱:ACQUITY UPLC BEH Shield RP18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流动相A:乙腈,流动相B:水,梯度洗脱(0～5 min,2%～10%A;5～9 min,10%～18%A;9～11 min,18%～24%A;11～24 min,24%～28%A;24～25 min,28%～2%A);检测波长:0～3 min为284 nm,3～25 min为224 nm;流速:0.3 mL·min-1;柱温:30 ℃;进样量:1 μL。

2.2.2 对照品溶液的制备 取5-羟甲基糠醛、红景天苷、松果菊苷、特女贞苷、女贞苷G13对照品适量,精密称定,加甲醇制成含量均为0.1 mg·mL-1的混合溶液,作为混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取样品粉末(过3号筛)约0.3 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,称定质量,超声(功率:500 W,频率:40 kHz)处理60 min,放冷,再称定质量,以70%甲醇补足减失质量,摇匀,采用0.22 μm滤膜滤过,取续滤液,即得。

2.2.4 精密度试验 精密称取酒女贞子样品,按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件重复进样6次,记录色谱图。以7号特女贞苷色谱峰为参照峰(S),计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积RSD分别为0.01%～0.09%和0.10%～0.78%,表明仪器精密度良好。

2.2.5 重复性试验 精密称取酒女贞子样品6份,按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件进样测定,记录色谱图。以7号特女贞苷色谱峰为参照峰(S),计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积RSD分别为0.01%～0.23%和0.19%～1.35%,表明该方法重复性良好。

2.2.6 稳定性试验 精密称取酒女贞子样品,按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,分别于室温放置0、2、4、8、12、24 h时,按“2.2.1”项下色谱条件进样测定,记录色谱图。以7号特女贞苷色谱峰为参照峰(S),计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积RSD分别为0.01%～0.34%和0.31%～2.96%,表明供试品溶液在室温下24 h内稳定。

2.2.7 女贞子UPLC特征图谱的建立 按“2.2.3”项下方法分别制备11批女贞子供试品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件进样测定,记录色谱图。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》对女贞子色谱图进行匹配,建立女贞子的特征图谱。以S1图谱作为参照,设置时间窗宽度为0.1 min,通过多点校正、全谱峰匹配生成11批女贞子的共有特征图谱,同时采用中位数法生成对照特征图谱。11批女贞子共有特征图谱中共标定了10个共有峰,女贞子共有特征图谱及对照图谱(R)详见图1。计算11批次女贞子UPLC特征图谱及生成的共有对照特征图谱的相似度,相似度均大于0.90,表明女贞子不同批次样品间质量一致性较好。

图1 女贞子的UPLC特征图谱及对照图谱(R)Fig.1 UPLC characteristic chromatogram and reference characteristic chromatogram (R)of Ligustri Lucidi Fructus

2.2.8 酒女贞子炮制过程的UPLC特征图谱评价 按“2.2.3”项下方法分别制备不同炮制工艺下的酒女贞子供试品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件进样测定,记录色谱图。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》对饮片压破后酒蒸(编号Y1～Y16)、饮片不压破酒蒸(编号Z1～Z16)及饮片不压破酒炖(编号D1～D16)8.0 h,每隔0.5 h取样的酒女贞子样品进行特征图谱炮制过程分析。不同炮制时间下饮片压破后酒蒸、饮片不压破酒蒸及饮片不压破酒炖的特征图谱如图2～4。通过与对照品比对(图5),确认3号峰为红景天苷,4号峰为松果菊苷,7号峰为特女贞苷,9号峰为女贞苷G13,11号峰为5-羟甲基糠醛。

图5 混合对照品色谱图Fig.5 Chromatogram of mixed reference substances

由图2～4可知，随着炮制时间的延长,3号峰的峰面积呈较明显的上升趋势,10号峰则呈较明显的下降趋势,其余各特征峰的峰面积整体趋于稳定；另外不同炮制时间下可新增1～4个特征峰,新增峰快慢顺序为11号峰>13号峰>12号峰>14号峰;饮片压破后酒蒸1.5 h(即Y3)、饮片不压破酒蒸2.5 h(即Z5)、饮片不压破酒炖8.0 h(即D16)即完成4个特征峰的新增,此时炮制的酒女贞子样品均已符合《中国药典》中“形如女贞子,表面黑褐色或灰黑色,常附有白色粉霜,微有酒香气”[1]的性状要求,表明新增4个特征峰可作为不同炮制方式下酒女贞子的炮制终点判断。饮片压破后酒蒸、饮片不压破酒蒸样品在蒸制约6 h后易出现“伤水”状态,不建议长时间酒蒸。随着炮制时间的延长,酒女贞子颜色逐渐变深后表面呈黑褐色,推测炮制后女贞子环烯醚萜类及苯乙醇苷类等主要活性成分发生了不同程度的分解与转化,且不同炮制方式及不同炮制时间下的分解与转化程度不同,高湿高热条件下的酒蒸方式会加快女贞子环烯醚萜类成分裂环上的酯键断裂生成红景天苷等苯乙醇苷类结构单元,酒炖在隔绝水蒸气的条件下化学成分的分解与转化则较缓慢[14-15]。

图2 女贞子压破后酒蒸炮制饮片的UPLC特征图谱Fig.2 UPLC characteristic chromatogram of Ligustri Lucidi Fructust with processing procedure of wine-steaming after crushing

图3 女贞子不压破酒蒸炮制饮片的UPLC特征图谱Fig.3 UPLC characteristic chromatogram of Ligustri Lucidi Fructust with processing procedure of wine-steaming without crushing

图4 女贞子不压破酒炖炮制饮片的UPLC特征图谱Fig.4 UPLC characteristic chromatogram of Ligustri Lucidi Fructust with processing procedure of wine-stewing without crushing

2.3 化学模式识别分析

2.3.1 聚类分析 聚类分析是一种无监督模式识别方法,将酒女贞子炮制过程中各个时间点样品的单位峰面积(缺峰的记为0)输入至SIMCA14.0软件中进行聚类分析,得图6。

图6 酒女贞子不同炮制过程样品聚类分析树状图Fig.6 Dendrogram of hierarchical cluster analysis of wine-processed Ligustri Lucidi Fructust with different processing procedure

图6显示,聚类分析将酒女贞子炮制过程中的样品分成了2大类,其中女贞子压破蒸制3.5～8.0 h和女贞子不压破蒸制8.0 h归为第Ⅰ类,其余女贞子压破酒蒸和女贞子不压破酒蒸以及酒炖样品归为第Ⅱ类;在第Ⅱ类下又可分为3小类,女贞子压破蒸制0.5～3.0 h归为第Ⅱa类,女贞子不压破酒蒸0.5～2.0 h和女贞子不压破酒炖0.5～4.0 h归为第Ⅱb类,女贞子不压破酒蒸2.5～7.5 h和女贞子不压破酒炖4.5～8.0 h归为第Ⅱc类。从归类结果可知女贞子饮片压破后蒸制对化学成分影响较大,即直接暴露在高湿高热条件下会加快女贞子环烯醚萜类及苯乙醇苷类等化学成分的分解与转化[12-13],且随着炮制时间的延长,压破酒蒸、不压破酒蒸和不压破酒炖的样品都会发生部分交叉,即在达到一定炮制时间点时,无论酒蒸或酒炖均可炮制出相似度高的酒女贞子样品,与2020年版《中国药典》酒女贞子炮制中“酒蒸或酒炖”一致,同时可将新增4个特征峰作为不同炮制方式下酒女贞子的炮制终点的判断。

2.3.2 PCA与OPLS-DA分析 在聚类分析的基础上,进一步采用PCA对酒女贞子不同炮制过程样品进行比较,通过数学降维的原理,从酒女贞子不同炮制过程样品原数据中提取几个具代表的综合性指标来代替多个原始变量。PCA分析结果中提取到3个特征值>1的主成分(PC),可用于反映酒女贞子不同炮制过程样品UPLC特征图谱93.91%以上的信息,其中PC1贡献率为58.8%,贡献率最大,PC2贡献率为22.7%。由前2个PC建立坐标系,得到酒女贞子不同炮制过程样品的PCA得分图(图7)。

图7 酒女贞子不同炮制过程样品的PCA得分图Fig.7 PCA score scatter plot of wine-processed Ligustri Lucidi Fructust with different processing procedures

由图7可见,女贞子压破酒蒸的样品能够较集中地聚集在一起,与不压破酒蒸或酒炖的样品有较明显的距离,而不压破酒蒸或酒炖的样品则交叉在一起,区分不明显。推测形成这种距离的主要原因为女贞子压破种皮后,直接暴露在高湿高热条件下,加快了环烯醚萜类及苯乙醇苷类等化学成分分解与转化的速度和程度。

图8 酒女贞子不同炮制过程样品的OPLS-DA得分图Fig.8 OPLS-DA score plot of wine-processed Ligustri Lucidi Fructust with different processing procedures

以模型变量投影(VIP)值为指标对引起酒女贞子不同炮制过程样品间差异的成分进行分析,筛选贡献较大的5个变量(以VIP值>1为标准),分别为10号峰(VIP=1.183)、1号峰(VIP=1.126)、9号女贞苷G13峰(VIP=1.064)、7号特女贞苷峰(VIP=1.059)和5号峰(VIP=1.047),提示上述5个成分是引起酒女贞子不同炮制过程样品间成分差异的主要标志性成分,其余峰VIP值<1,对样品的区分影响较小。详见图9。

图9 酒女贞子不同炮制过程样品14个共有峰的VIP值Fig.9 VIP values of 14 common peaks of wine-processed Ligustri Lucidi Fructust with different processing procedures

2.4 含量测定

2.4.1 色谱条件 同“2.2.1”项下。

2.4.2 对照品溶液的制备 分别取红景天苷、特女贞苷、女贞苷G13对照品适量,精密称定,分别加甲醇制成质量浓度为200 μg·mL-1的红景天苷对照品溶液,200 μg·mL-1的特女贞苷对照品溶液,200 μg·mL-1的女贞苷G13对照品溶液。

2.4.3 供试品溶液的制备 同“2.2.3”项。

2.4.4 专属性考察 取上述供试品溶液、阴性对照溶液(70%甲醇)和“2.4.2”项下的对照品溶液各适量,按“2.2.1”项下色谱条件进样测定,记录色谱图。结果见图10,女贞子供试品及对照品色谱图的基线均平稳,色谱峰分离度、对称性良好,供试品中各色谱峰与对照品各对应色谱峰的保留时间基本相同,且阴性对照无干扰。

图10 女贞子专属性考察的UPLC色谱图Fig.10 UPLC characteristic chromatogram of the exclusive investigation of Ligustri Lucidi Fructust

2.4.5 线性关系考察 分别精密称取红景天苷,特女贞苷,女贞苷G13对照品适量,分别加甲醇制成质量浓度为301.18、120.47、60.24、30.22、12.13 μg·mL-1的红景天苷,247.76、100.13、49.59、24.70、9.88 μg·mL-1的特女贞苷,271.13、101.08、59.28、27.17、10.83 μg·mL-1的女贞苷G13系列对照品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件进样分析。以进样质量浓度(X，μg·mL-1)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归,得回归方程,结果见表2。

表2 3个成分的线性回归方程与线性范围Table 2 Linear regression equations with linear ranges for the three components

2.4.6 精密度试验 精密称取酒女贞子样品,按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件重复进样6次,记录峰面积。红景天苷、特女贞苷、女贞苷G13峰面积的RSD分别为0.60%、0.30%、0.23%(n=6),表明仪器精密度良好。

2.4.7 重复性试验 精密称取酒女贞子样品6份,按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件进样测定,记录峰面积并按外标法计算样品中各待测成分的含量。红景天苷、特女贞苷、女贞苷G13含量的RSD分别为0.62%、0.73%、0.76%(n=6),表明该方法重复性良好。

2.4.8 稳定性试验 精密称取酒女贞子样品,按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,分别于室温放置0、2、4、8、12、24 h,按“2.2.1”项下色谱条件进样测定,记录峰面积。红景天苷、特女贞苷、女贞苷G13峰面积的RSD分别为4.84%、2.94%、2.43%(n=6),表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.9 加样回收率试验 精密称取含量已知的酒女贞子样品0.15 g,置具塞锥形瓶中,按样品中红景天苷、特女贞苷、女贞苷G13含量的50%、100%和150%分别加入相应的对照品,每个指标成分设计3组实验,每组平行3份。按“2.2.3”项下方法制备供试溶液,在“2.2.1”项色谱条件下进行测定,计算加样回收率,结果见表3。

表3 3个成分的加样回收率试验结果(n=9)Table 3 Results of additional sample recovery test for three components (n=9)

2.4.10 样品测定 取不同炮制工艺下酒女贞子样品,按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,再按照“2.2.1”项下色谱条件进行测定,计算各成分含量,结果见图11。由含量测定结果可知红景天苷含量随着炮制时间的延长而呈上升趋势,上升趋势快慢为女贞子压破酒蒸>女贞子不压破酒蒸>女贞子不压破酒炖,其可能与女贞子压破种皮后,直接暴露在高湿高热条件下,加快了其他化合物分解转化成红景天苷结构单元的速率有关。特女贞苷和女贞苷G13均为女贞子中裂环环烯醚萜类的代表成分,在8.0 h炮制时间内,不同炮制条件下随着炮制时间的延长2种成分都趋于稳定;但与炮制0 h(即女贞子药材)相比,压破酒蒸样品含量稍有升高,而不压破酒蒸和酒炖样品含量均稍有下降,可能与取样过程中样品存在差异有关,也可能是由于未压破的女贞子在炮制过程中受到种皮的保护作用,避免了与水蒸气的直接接触,炮制初始裂环环烯醚萜成分的降解速率大于闭环环烯醚萜类物质裂解为裂环环烯醚萜类成分的速率,后随着炮制时间的延长两者降解速率相近[14]。

3 讨论

本实验考察了提取溶剂(甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、50%乙醇、70%乙醇),提取方式(超声,回流),提取溶剂用量(10、25、50、75 mL),提取时间(30、45、60 min)等供试品制备条件,结果发现,选择乙醇系统作为提取溶剂时,存在2号峰和11号5-羟甲基糠醛峰缺失的情况,以纯甲醇作为提取溶剂时3号红景天苷峰的峰型不对称,易变形,故优选了各色谱峰峰形对称、分离效果好且响应值高的70%甲醇作为提取溶剂;另优选了超声提取方式、提取溶剂25 mL和提取时间60 min的供试品制备条件,得到的UPLC特征图谱各色谱峰能够满足分析要求。

本研究通过采用合适的UPLC色谱条件能够同时建立女贞子和酒女贞子的特征图谱,除标定了女贞子特征图谱的10个共有峰外,还能够直观地监控酒女贞子炮制过程中新增的1～4个特征峰的变化情况。对酒女贞子炮制过程中的样品进行无监督模式聚类分析和PCA,其分析结果均将女贞子压破酒蒸与女贞子不压破酒蒸、酒炖区分为2大类,而女贞子不压破酒蒸、酒炖样品间则随着炮制时间的不同部分交叉聚在一起。可能因为女贞子压破种皮后,直接暴露在高湿高热条件下,会加快其环烯醚萜类及苯乙醇苷类等化学成分的分解与转化的速度和程度,从而造成女贞子压破酒蒸和女贞子不压破酒蒸、酒炖样品间的差异。通过监督模式识别法进一步进行OPLS-DA,能将原始数据X中与因变量Y中不相关的信息去除,提高类内聚集性,使类与类之间的差异性得到最大化,结果显示女贞子压破酒蒸、女贞子不压破酒蒸和女贞子不压破酒炖明显区分为3类,且1、5、7、9、10号峰是引起酒女贞子不同炮制样品间成分差异的主要标志性成分,表明聚类分析和PCA中交叉聚在一起的样品,可通过OPLS-DA进一步区分出来,其差异或体现在化学成分种类、含量及化学成分的比例关系上,可能是炮制后的酒女贞子滋补肝肾作用增强,寒凉之性减弱的主要原因[16]。

注:YP-JZ.压破后酒蒸;BYP-JZ.不压破酒蒸;BYP-JD.不压破酒炖图11 酒女贞子炮制过程中含量变化趋势图Fig.11 Trend chart of the changing contents of the wine-processed Ligustri Lucidi Fructust during the different processing procedure

本研究建立的UPLC特征图谱及主要指标成分的筛选能够对女贞子药材及其炮制品中的红景天苷、特女贞苷和女贞苷G13这3种指标成分进行定量,弥补了2020年版《中国药典》未能同时检测女贞子药材及其炮制品中特女贞苷含量和红景天苷含量的空白,还增加了含量较高的裂环环烯醚萜类成分女贞苷G13的含量测定,其含量结果表明红景天苷随着炮制时间的延长含量显著增加,提示很可能是由于女贞子中环烯醚萜类化学成分在加水、加热的条件下,其裂环上的酯键和环烯醚萜部分的氧苷键水解断裂,生成次级苷或者苷元红景天苷等[15];在8.0 h炮制时间内,特女贞苷和女贞苷G13含量则随着炮制时间的延长稍有下降,但整体趋于稳定。前人研究结果表明，炮制后环烯醚萜类成分含量呈下降趋势可能体现在炮制时间、温度及湿度等差异上,即炮制时间越长、温度及湿度越高,环烯醚萜类成分含量可能下降得越明显[12,14]。本研究建立的UPLC特征图谱和含量测定方法能较全面地反映女贞子药材及其不同炮制工艺下的酒女贞子质量,可为女贞子药材及酒女贞子炮制过程的质量控制提供科学的检测和鉴别方法。