胡婧 李爱红 冯金荣

(1. 南通大学医学院病原生物学系，南通 226001；2. 南通大学附属医院神经内科，南通 226001)

真菌感染临床常见，主要包括浅部感染和深部感染，一般侵犯皮肤黏膜、指甲等，组织反应较轻，但严重时可侵染组织和内脏，引起全身播散性感染，甚至引起免疫受损人群的死亡[1]。白念珠菌是一种常见的真菌病原，其导致的感染占所有念珠菌属感染的50%左右[2]。研究发现，白念珠菌的致病性与多种致病因子相关，包括黏附分子(纤连蛋白)、形态改变(单细胞酵母细胞和菌丝态细胞的转换)、菌体分泌蛋白水解酶类(天冬酰胺蛋白酶、磷脂酶)、生物膜的形成等[3]。

研究发现，蛋白质的翻译后修饰与白念珠菌的形态调控存在密切联系。其中，SUMO(small ubiquitin-like modifier)是一种小分子泛素样修饰蛋白，作为翻译后修饰的重要手段，可在不同生理条件下与蛋白质进行共价连接，以调节其生物学功能。酿酒酵母中，SMT3是SUMO家族的唯一成员，为必需基因，但通过表达人类SUMO-1可以回复SMT3纯合子缺失突变体的致死性[4]。酿酒酵母SUMO蛋白酶Ulp2的缺失会逆转SUMO蛋白的修饰作用，严重影响细胞的适应性[5]。白念珠菌中，SUMO连接酶(E3)Wos1与细胞白-灰转换调节因子Wor1相互作用并调节Wor1的SUMO化修饰[6]。目前，白念珠菌中单一的SUMO编码基因SMT3已被鉴定，其缺失影响细胞形态，对氧化胁迫和细胞壁胁迫敏感。但SMT3的这些生物学功能对其在致病性过程中的影响却尚未知[7]。

白念珠菌毒力研究常用的动物模型包括小鼠、线虫等。近来，大蜡螟(Galleriamellonella)幼虫作为宿主研究病原体的致病作用，逐渐受到学者的重视[8]。相对于小鼠等，大蜡螟具有操作简便、购买便捷且价格低廉、生命周期短等优势，且其毒力实验结果与哺乳动物模型有很好的均一性。目前，大蜡螟幼虫作为宿主研究病原体的致病作用已在国际上有较多报道[9-11]，但国内学者利用大蜡螟模型研究白念珠菌的致病作用却相对较少。本文主要建立大蜡螟感染白念珠菌模型，并探索SMT3基因在白念珠菌致病性调控中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株与质粒 白念珠菌野生型菌株SN148、pV1093和pFA-HA-ARG4质粒由加拿大康考迪亚大学Whiteway教授馈赠。

培养基 酵母浸膏蛋白胨葡萄糖培养基(yeast extract pentose dextrose medium，YPD medium)、酵母氮源培养基(yeast nitrogen base medium，YNB medium)和合成培养基(synthetic defined medium，SD medium)等均按标准配方配制；固体培养基中添加2%琼脂粉。SD-Arg-Ura选择性培养基中缺少精氨酸、尿嘧啶。

主要试剂 常规Taq酶购自北京全式金生物技术公司；OneTaq购自NEB公司，StuⅠ内切酶购自TAKARA公司；PCR产物纯化试剂盒购自北京天漠生物科技公司；LiAC、ssDNA等常规生化试剂购自上海生工生物工程股份有限公司；DNA Marker购自上海捷瑞生物工程公司；大蜡螟购自河南科云生物公司。

1.2 方法

引物设计与合成 白念珠菌SMT3基因核酸序列来自白念珠菌基因组数据库(http://www.candidagenome.org/)，序列分析和引物设计经由Benchling网站(http://www.benchling.com)在线分析完成。引物由上海捷瑞生物工程公司合成。本研究相关引物见表1。

表1 引物序列

白念珠菌的转化 参考前文方法[12]，将白念珠菌野生型菌株SN148过夜培养后用于转化，转化子涂布于固体SD-Arg选择培养基，30℃培养2～3 d后检查转化子生长情况。

白念珠菌菌落PCR 挑取纯化后的新鲜转化子，采用NEB公司的OneTaq酶直接进行PCR反应。

SMT3基因缺失菌株的构建 采用瞬时CRISPR/Cas9 系统构建SMT3缺失菌株：利用引物P7和P8，以pV1093质粒为模板，PCR扩增Ca9基因；利用引物P1和SMT3-sg-R扩增sgRNA-1片段，利用引物SMT3-sg-F和P4扩增sgRNA-2片段，并以sgRNA-1和sgRNA-2片段为模板，以P5和P6为引物，PCR扩增完整的sgRNA片段；以pFA-HA-ARG4为模板，SMT3-Re-F和SMT3-Re-R为引物，PCR扩增出修复片段。将Cas9、sgRNA和修复片段共转化白念珠菌野生型菌株，将转化子纯化后，利用SMT3-Te-F和SMT3-Te-R进行菌落PCR检测。

SMT3基因缺失菌株的形态检测 将白念珠菌野生型菌株SN148和SMT3缺失株分别接种至YPD液体培养基中，过夜培养至稳定期后于光镜下观察菌体形态。同时，将菌液进行1/10梯度稀释，分别取3 μL原液、10-1、10-2、10-3、10-4梯度稀释液点接到YPD固体培养基上，于30℃培养2～3 d，观察菌株生长情况。随后，用流水沿平板表面缓慢冲洗(不直接冲洗菌落)，直至无明显菌体被洗下，检查菌体侵入培养基的情况。

SMT3基因缺失株的生物被膜形成试验 根据前文方法[13]，检测白念珠菌野生型SN148和SMT3缺失株的生物被膜形成情况。

毒力实验 本实验使用的大蜡螟幼虫体重均为300～400 mg，舍弃活力较弱有黑色斑点的不健康幼虫，保留体态匀称、色泽莹白的健康幼虫。随机挑选10条健康幼虫置于同一培养皿中为一组。将白念珠菌过夜培养物，进行超声处理以离散黏连细胞，并用生理盐水稀释后涂布YPD固体培养基，于30 ℃培养2～3 d后进行菌落计数，并将原液用生理盐水稀释至5×107CFU/mL。微量注射器(高鸽，25 μL)用75%乙醇浸泡灭菌10 min，用无菌水冲洗3次。用微量注射器吸取10 μL白念珠菌悬液，从大蜡螟幼虫倒数第二足刺入完成注射。注射后观察幼虫，如出现5～8 h内迅速恶化的幼虫则视为注射失败并剔除出实验。注射完成后，将幼虫置于30 ℃避光培养，每天观察生存情况并记录。将濒死虫体置于10%中性福尔马林固定液中浸泡48 h，取出后置于30%蔗糖溶液中脱水48 h，进行冰冻切片，并利用PAS糖原染色试剂盒(北京索莱宝)进行染色。

大蜡螟幼虫血细胞分析 为观察大蜡螟血细胞中白念珠菌，利用CAI4-GFP (ura3::imm434/ura3::imm434 pAM5.6)菌株，其自身已携带GFP绿色荧光标记。为研究白念珠菌感染大蜡螟幼虫后的血细胞，随机挑选4条健康幼虫于同一培养皿中为一组，分别将10 μL白念珠菌野生型菌株SN148、SMT3缺失株悬液(5×107CFU/mL)注射大蜡螟幼虫，20 h后取血淋巴。将20 μL血淋巴与20 μL的台酚蓝染液混匀，于光镜下用血球计数板进行血细胞计数并分析结果。

2 结 果

2.1 SMT3基因缺失菌株构建

采用CRISPR/Cas9系统敲除SMT3基因[12]：分别于体外扩增Cas9基因、SMT3基因sgRNA和带有ARG4标记的修复DNA片段，转化后通过菌落PCR直接鉴定转化子基因型(见图1A)。利用检测引物SMT3-Te-F和SMT3-Te-R，在野生型菌株中能扩出约1.0 kb条带，而SMT3基因被ARG4替换后，则能扩出约3.0 kb的片段。如图1A所示，1～4泳道中转化子能扩出单一的约3.0 kb片段，表明SMT3基因敲除成功。

2.2 SMT3基因缺失对形态发生和生物被膜形成的影响

研究表明，SMT3基因缺失导致液体培养基中白念珠菌呈菌丝状生长[7]，本实验进一步检测了SMT3基因缺失株在固体培养基中的侵入生长能力。在YPD液体培养基中，SMT3缺失株细胞串珠样比例明显上升，细胞普遍伸长；而野生型菌株在镜下呈典型的酵母态(见图1B)。在YPD固体培养基上，野生型菌株SN148菌落较为平整；而SMT3缺失株菌落表面和边缘粗糙；用流水缓慢冲洗后，SMT3缺失株几乎不能被洗去，呈现较强的侵入生长能力(见图1C)。

鉴于白念珠菌菌丝态生长和生物被膜形成有一定的相关性，本实验通过生物被膜形成实验发现，与野生型菌株相比，SMT3缺失株的生物被膜形成能力明显增强，A595值=1.0，约为野生型菌株的2.5倍(见图1D)。

图1 SMT3缺失株的基因型检测及形态分析. A. SMT3敲除与检测; B. 液体培养基中SMT3缺失株的形态; C. SMT3缺失株在固体培养基上的浸入生长分析; D. SMT3缺失株的生物被膜形成实验(成对样本t检测)

2.3 SMT3基因缺失菌株的毒力检测

为检测SMT3基因缺失对白念珠菌毒力的影响，本研究建立了大蜡螟感染模型，检测了SMT3缺失株的毒力，并以野生型菌株为对照。注射10 d后，生理盐水组大蜡螟幼虫(n=5)全部保持存活，表明注射不会明显伤及大蜡螟的存活；感染野生型菌株的幼虫注射后逐渐死亡，10 d时仍有3只虫体保持存活，平均存活期为8.5 d；注射SMT3缺失株的幼虫9 d时全部死亡，平均存活期仅为3.5 d(见图2A、2B)。这一结果表明，SMT3基因的缺失导致白念珠菌致病能力上升。通过组织切片也发现(见图2C)，白念珠菌SMT3缺失株和野生型菌株均能在大蜡螟幼虫体内以菌丝态形式存在。

图2 SMT3基因缺失对白念珠菌致病性的影响. A. 感染白念珠菌大蜡螟幼虫的生存曲线； B. 受感染大蜡螟幼虫的存活情况； C. 受感染大蜡螟幼虫组织切片(糖原染色) 图3 SMT3缺失对血细胞的破坏作用. A大蜡螟血细胞与白念珠菌互作； B. 大蜡螟幼虫血细胞总数测定(成对样本t检测)

2.4 SMT3缺失对大蜡螟血细胞的破坏作用检测

为进一步分析SMT3缺失株对大蜡螟的致病作用，我们检测了感染白念珠菌后大蜡螟血细胞的存活情况。将带有GFP荧光标记的白念珠菌野生型菌株注射大蜡螟后，发现其血细胞中带有绿色荧光信号；随着感染时间延长，较多数量的血细胞携带绿色荧光信号，说明大蜡螟血细胞可以吞噬白念珠菌(见图3A)。随后，我们分析了感染白念珠菌野生型菌株和SMT3缺失株后大蜡螟的血细胞数量，结果发现感染SMT3缺失株的大蜡螟幼虫中存活的血细胞数约为1.4×107/mL，明显低于野生型组(2.9×107/mL,P<0.05)，说明SMT3缺失导致白念珠菌对大蜡螟幼虫血细胞的破坏作用增强(见图3B)。

3 讨 论

白念珠菌的菌体形态与其致病性存在密切联系，探索其形态发生机制对阐明白念珠菌的致病机理及临床白念珠菌病的防治具有重要的指导意义。本实验通过CRISPR/Cas9基因敲除系统快速构建了SMT3纯合子缺失菌株，发现SMT3基因缺失导致细胞在液体培养基中呈菌丝状生长，在固体培养基中呈现侵入生长，这一结果与SUMO聚合酶UBC9和连接酶MMS21等基因缺失株细胞形态类似，说明SUMO修饰相关基因在形态调控中发挥类似的作用[13-14]。但迄今未有对SUMO修饰相关基因在白念珠菌致病性调控中的作用进行研究。本文发现SMT3缺失导致白念珠菌在大蜡螟模型中毒力显著增强，通过分析大蜡螟血细胞发现，其对血细胞的破坏作用也显著增强。白念珠菌的菌丝状生长对于其逃逸宿主免疫细胞的杀伤以及深部感染有重要作用[15]。本文发现，SMT3缺失导致细胞呈菌丝状生长，可能增强了其通过菌体延伸逃逸并破坏大蜡螟血细胞的作用，表现出毒力增强。实验中，SMT3缺失导致血细胞数量减少也进一步验证了这一推测。需要指出的是，由于SMT3缺失株呈现菌丝状生长，导致细胞黏连，难以通过常规的血球计数板进行计数，而通过平板CFU计数可能会导致细胞数偏大，部分影响其毒力情况。此外，本实验中敲除SMT3基因时引入了ARG4标记，也可能会对毒力实验结果造成一定的影响。后续仍需进一步验证SUMO修饰其他相关基因如SUMO聚合酶UBC9、SUMO连接酶MMS21、SIZ1等在致病性调控中的作用，以明确SUMO修饰相关途径对白念珠菌致病性的调控作用。

哺乳动物的先天免疫反应与真菌病原体的防御有关，这种免疫反应也同样存在于昆虫体内，因此分析昆虫对真菌病原体的应答对研究真菌毒力有一定意义[16]。相对于小鼠等动物模型，大蜡螟幼虫易于购买和接种，无需投入大量资金和进行复杂操作；由于幼虫体积小、生命周期短，它们易于处理且能在短期内提供结果；幼虫的死亡率、血细胞(免疫细胞)数量的变化及幼虫血细胞内病原体的增殖程度，都是检测菌体毒性和虫体免疫反应的良好指标。因此，大蜡螟幼虫为测定微生物毒性提供了一种简便快速的方法，也成为了此类实验中哺乳动物模型的有效替代品[8,17]。本文的结果，对进一步将大蜡螟模型广泛应用于白念珠菌及其他致病微生物毒力和致病机制研究具有一定的指导意义。